GST pulldown
GST pull-down實(shí)驗(yàn)是一個(gè)行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù),近年來(lái)越來(lái)越受到廣大學(xué)者的青睞。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
GST pulldown實(shí)驗(yàn)是一個(gè)有效驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)。
基本原理：將靶蛋白-GST 融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過(guò)柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物通過(guò) SDS-PAGE 電泳分離，最后經(jīng)western blot或質(zhì)譜分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用；
1. 確定某一個(gè)蛋白質(zhì)與另一個(gè)蛋白質(zhì)的直接作用關(guān)系。
2. 篩選某一個(gè)蛋白質(zhì)直接結(jié)合的蛋白質(zhì)族群。
3. 驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)果的有效性。
【技術(shù)原理圖】
案例展示
優(yōu)勢(shì)與不足
優(yōu)勢(shì)：
1. 區(qū)別于CoIP，GST pull down技術(shù)可以明確兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否直接作用。
2. 可用于篩選與目的蛋白質(zhì)直接結(jié)合的蛋白質(zhì)族群。
3. 可聯(lián)合酵母雙雜交系統(tǒng)綜合評(píng)估蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，是一個(gè)有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)。
不足：
1. 體外表達(dá)的重組蛋白，無(wú)法完全模擬特定生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)活性及結(jié)合情況。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類(lèi)型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過(guò)量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過(guò) 10μm，2~8 張，表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說(shuō)明書(shū)要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說(shuō)明書(shū)。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號(hào)
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