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大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起整理了這些疑問部分，希望和大家交流學習~

WB實驗(Western Blot，蛋白質印跡)是一種用于檢測特定蛋白質在復雜樣品中存在及其相對表達量的分子生物學技術其主要步驟為:樣品制備→電泳→轉膜→封閉→抗體孵育→>檢測(顯影和成像)

——常見疑問合集

一.Marker
1.什么是Marker ?

Marker是蛋白分子量標準，一些已知分子量的蛋白質的混合物，用于指示蛋白質條帶的大小。可以類似為一把“尺子”，驗證目的蛋白的分子量。

2.Marker的作用是什么?

①指示待測蛋白分子量

②顯示蛋白在凝膠上的電泳進度
③可協(xié)助標記加樣順序4)判斷轉膜效率

④判斷轉膜效率

3.Marker的分類

①未預染Marker:

優(yōu)點:非預染蛋白沒有附帶染料分子或標記分子，指示大小正好是蛋白原本的大小，所以最準確。

缺點:非預染蛋白Marker在電泳過程中看不到，電泳結束后經過蛋白染色后才能起指示作用，無法在實驗過程中起預示作用。

②預染Marker:(wb常用)

優(yōu)點:肉眼看見，可直接觀察電泳進程和轉膜是否完全，較為常用。

缺點:Marker蛋白跟染料共價偶聯(lián)導致蛋白分子電泳的遷移效率發(fā)生改變，其指示的分子量不是精確值而有一定誤差。

3 曝光Marker.

在曝光步驟中，可將目的條帶和Marker條帶同時曝光顯示，減小誤差，并克服了但克服了預染 Marker 遷移率的改變，但價格昂貴

4.預染Marker的選擇:

①分子量范圍

蛋白marker分為低分子量，寬分子量，高分子量幾類。根據需求選擇

②質量和穩(wěn)定性

③與膜的親和性

二.轉膜

1.轉膜的原理

將凝膠中分離的蛋白質轉移到與其具有高度親和力的膜上(一般常用pvdf膜)，使蛋白后續(xù)更容易與抗體結合，便于后續(xù)抗體檢測。

原理:利用電場使帶負電的蛋白質從凝膠向正極移動，最終附著在膜上。

2.轉膜過程中甲醇的作用

轉膜液中甲醇的作用∶

① 增強蛋白質與膜的結合

甲醇能去除蛋白質表面的SDS，使蛋白質更容易與膜(如PVDF或硝酸纖維素膜)結合，提高轉膜效率。

② 防止凝膠膨脹

結合，提高轉膜效率。

② 防止凝膠膨脹

甲醇能防止凝膠過度吸水膨脹，保持凝膠結構穩(wěn)定，確保蛋白質有效轉移。

③甲醇能改善蛋白質從凝膠向膜的轉移,特別是對高分子量蛋白質效果顯著。

甲醇激活PVDF膜的作用:

①用甲醇激活PVDF膜，可以將膜從疏水性變?yōu)橛H水性,提高膜對蛋白質的吸附能力。

②甲醇可以減小膜的孔徑，讓PVDF膜的孔徑變小，防止小分子量蛋白質在轉膜過程中丟失。

三.封閉

1.孵育一抗體前為什么需要用脫脂牛奶封

閉?

膜具有高蛋白結合能力，可以結合任何可用的蛋白，包括用于檢測的抗體。如果不進行封閉處理，抗體可能會非特異性地結合到膜上未被樣品蛋白占據的位置，導致高背景信號

合到膜上未被樣品蛋白占據的位置，導致高背景信號。

封閉的作用

①減少非特異性背景:封閉劑通過占據空白位點，阻止抗體非特異性結合，從而降低背景噪音，使條帶更清晰。

②增強特異性信號:有效的封閉可以幫助抗體更專一地結合到其目標蛋白，提高檢測的特異性。

(脫脂牛奶是最常用的封閉劑，成本低廉且富多種蛋白。但不宜用于磷酸化蛋白檢測，磷酸1蛋自盡量使用BSA)

四.孵育抗體

1.一抗二抗的原理，為什么需要使用二抗?

原理

一抗的作用是特異性識別目標蛋白的某個抗原表位，這個過程是由一抗的可變區(qū)(Fab區(qū))完成的。二抗識別并結合一抗的恒定區(qū)(Fc區(qū))，而不是目標蛋白本身

2..為什么需要使用二抗？

①二抗可以通用

同一種動物來源的抗體恒定區(qū)是相同的,因此只需要制造一種通用的二抗(如抗免二抗)就可以用于所有由免子產生的一抗，無論這些一抗識別的是哪種蛋白。②放大信號

一個一抗可以結合多個二抗，多個二抗的結合帶來了更多的信號分子，從而增強目標蛋白的信號。

3..稀釋一抗二抗一般使用什么液體?

因此只需要制造一種通用的二抗（如抗兔二抗），可以用于所有由兔子產生的一抗

3.一抗二抗一般使用什么液體 ?

二抗稀釋配方：PBST/TBST+5% BSA（血清白蛋白），比例 1:5000~60000

(Tween-20可以幫助稀釋的二抗均勻分散，并提高其與目標蛋白的結合。

BSA可以作為阻斷劑，降低非特異性結合，提高實驗的特異性）

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