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【鑒定方法】

基于SEC+超濾的外泌體分離方法，可方便快捷進(jìn)行高純度及高回收率的外泌體分離。以熒光外泌體作為標(biāo)準(zhǔn)品，Exosupur可回收94.87%的熒光外泌體；能夠去除99.44%的血漿游離雜蛋白，如主要的miRNA結(jié)合蛋白Ago、血漿雜蛋白HAS在Exosupur中更少；跟超離及市面常見(jiàn)試劑盒相比，該方法提取的外泌體的particle數(shù)與蛋白含量比值更高，表明分離得外泌體純度更高，雜蛋白含量更低。

MISEV2018（細(xì)胞外囊泡雜志）對(duì)外泌體的表征規(guī)定了最小試驗(yàn)要求：

① 總體表征：

至少3個(gè)陽(yáng)性（至少包括1個(gè)跨膜蛋白和1個(gè)細(xì)胞溶質(zhì)蛋白）、1個(gè)陰性蛋白質(zhì)標(biāo)志物。

② 個(gè)體表征：

電鏡或原子力顯微鏡、單顆粒追蹤兩種方法互為補(bǔ)充。

1、電鏡檢測(cè)

透射電子顯微鏡觀察法（TEM）是從形態(tài)和大小上對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。通過(guò)負(fù)染的方法，在高倍放大下直接觀察單個(gè)外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小。

檢測(cè)儀器：透射電子顯微鏡（HITACHI，H-7650）

樣本要求：BCA濃度300-400ng/μl，體積10μl；避免反復(fù)凍融，4℃保存，冰袋運(yùn)輸。

結(jié)果呈現(xiàn)：

2、粒徑檢測(cè)

粒徑分析是從整體上對(duì)外泌體大小的分布情況進(jìn)行檢測(cè)，具有準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是對(duì)現(xiàn)有外泌體鑒定方法的良好補(bǔ)充。

檢測(cè)儀器：Particle Metrix（ZetaView）

樣本要求： 避免反復(fù)凍融，4℃保存，冰袋運(yùn)輸。

結(jié)果呈現(xiàn)：

3、Western Blot檢測(cè)

Western blot是通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，對(duì)外泌體標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測(cè)，從蛋白質(zhì)層面對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。常用的外泌體標(biāo)志蛋白包括CD63、TSG101及Alix等。

檢測(cè)方法：ECL化學(xué)發(fā)光，傳統(tǒng)膠片曝光或者專(zhuān)用曝光儀器。

樣本要求：血漿樣本BCA量60ug，＞0.5μg/μl；細(xì)胞上清BCA量40μg，＞0.5μg/μl；冰袋運(yùn)輸。

結(jié)果呈現(xiàn)：

【常見(jiàn)問(wèn)題】

1、血漿電鏡圖片為什么背景那么雜？

答：血漿中雜蛋白如糖蛋白、鐵蛋白，低密度脂蛋白等粒徑大小與外泌體非常接近，且

含量偏高，現(xiàn)有的分離方法無(wú)法完全剔除，所以會(huì)出現(xiàn)有一些雜蛋白背景。

2、CD63 條帶為什么呈彌散狀？這樣發(fā)文章能用嗎？

答：由于 CD63 的糖基化水平不同，導(dǎo)致其條帶呈彌散狀，這是蛋白本身的特點(diǎn)，所以不會(huì)

影響文章的發(fā)表。

【送檢標(biāo)準(zhǔn)】

（一）、血漿樣本采集

1、請(qǐng)用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)4 h）；

2、將采集到的血液在4℃下1500 g，離心20 min，去除血液中的細(xì)胞；

3、取上清，4℃下3000 g，離心15 min，收集上清（血漿），-80℃保存。

4、送樣量： 排阻+超濾      4mL（夠2次分離）

             超離      4mL

注意事項(xiàng)：①請(qǐng)勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放；②請(qǐng)排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。

（二）、血清樣本采集

1、請(qǐng)用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)4 h）；

2、將采集到的血液在4℃下1500 g，離心20 min，去除血液中的細(xì)胞；

3、取上清，4℃下13000 g，離心2 min，收集上清（血清），-80℃保存。

4、送樣量：       超離      4 mL

                排阻+超濾      1mL

注意事項(xiàng)：請(qǐng)排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。

（三）、尿液樣本采集

1、采集前/中后段晨尿約60 mL，若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)8 h）；

2、將采集到的尿液在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20 min，去除尿液中的細(xì)胞；-80℃保存；

3、送樣量：60 mL。

注意事項(xiàng)：請(qǐng)務(wù)必囑咐患者，①采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；②中段尿請(qǐng)務(wù)必去掉最初排出的50-80 mL尿液；③女性受試者，請(qǐng)于采尿前對(duì)外陰進(jìn)行清洗。

（四）、胸水樣本采集

1、臨床收集胸水后若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)8 h）；

2、將收集到的胸水1000 g離心10 min，收集上清液；

3、將得到的胸水上清3000 g離心10 min，收集上清，-80℃保存。

4、送樣量：30 mL

（五）、腹水樣本采集

1、臨床收集腹水后若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)8 h）；

2、將采集到的腹水在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20 min，去除腹水中的殘?jiān)?80℃保存；

3、送樣量：30 mL。

（六）、腦脊液樣本采集

1、采集方式為腰椎穿刺，樣本一經(jīng)分離，請(qǐng)務(wù)必立即置于冰上或4℃短暫保存（不得超過(guò)4 h），采樣時(shí)注意避免血液污染；

2、樣本室溫下2000 g離心20 min去除細(xì)胞及部分碎片，取上清，-80℃保存；

3、送樣量：5 mL。

注意事項(xiàng)：請(qǐng)勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放。

（七）、膽汁樣本采集

1、用無(wú)菌容器收集膽汁；

2、將收集到的膽汁在4℃下，3000 g離心10 min去除細(xì)胞沉渣和碎片；

3、收集膽汁上清液，4℃或者-20℃長(zhǎng)期保存；

4、送樣量：5 mL。

（八）、細(xì)胞樣本采集

對(duì)于耐受無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞的處理流程：

1、細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)于貼壁細(xì)胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細(xì)胞2-3遍去除殘留牛血清，添加無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；

2、上清收集：細(xì)胞上清先用200-300g離心10min，再用3000g離心10min，最后0.22um過(guò)膜或者10000g離心30min。將處理后的細(xì)胞上清經(jīng)100kd超濾管超濾濃縮（詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)2.1）；

3、儲(chǔ)存運(yùn)輸：將處理好的細(xì)胞上清收集在無(wú)菌培養(yǎng)瓶，-80保存或者干冰運(yùn)輸，體積需求細(xì)胞上清原液大于200ml（對(duì)應(yīng)于10cm的大皿，至少需要20大皿）；

4、對(duì)于一些狀態(tài)良好的細(xì)胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結(jié)果。

對(duì)于不耐受無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞的處理流程：

1、細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)于貼壁細(xì)胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細(xì)胞2-3遍去除殘留牛血清，添加含5%無(wú)外泌體血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；

2、上清收集：細(xì)胞上清先用200-300g離心10min，再用3000g離心10min，最后0.22um過(guò)膜或者10000g離心30min。將處理后的細(xì)胞上清經(jīng)100kd超濾管超濾濃縮（詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)2.1）；

3、儲(chǔ)存運(yùn)輸：將處理好的細(xì)胞上清收集在無(wú)菌培養(yǎng)瓶，-80保存或者干冰運(yùn)輸，體積需求細(xì)胞上清原液大于200ml（對(duì)應(yīng)于10cm的大皿，至少需要20大皿）；

4、對(duì)于一些狀態(tài)良好的細(xì)胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結(jié)果。

5、送樣量：細(xì)胞上清原液建議大于200 mL。

注：細(xì)胞上清樣本按照送樣體積收費(fèi)，超濾濃縮步驟可選擇自己完成也可直接送公司完成。

參考文獻(xiàn)：Rong Xu, David W. Greening , Alin Rai, Hong Ji, Richard J. Simpson. Highly-purified exosomes and shed microvesicles isolated from the human colon cancer cell line LIM1863 by sequential centrifugal ultrafiltration are biochemically and functionally distinct. Methods. 2015 .1;87:11-25

【交付標(biāo)準(zhǔn)】