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         Western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡）實驗操作常見問題原因及由普拉特澤生物旗下生物科研培訓(xùn)品牌《春風(fēng)學(xué)院》總結(jié)分享，普拉特澤生物提供線下WB實驗外包與實驗理論實操的線上下培訓(xùn)，實驗真、周期短、人才廣、技術(shù)高！

   上篇咱們分享了Western blot實驗結(jié)果中背景較高、無目的條帶兩個常見問題都還記得嗎？不記得可點(diǎn)擊《Western blot檢測實驗常見問題原因以及解決方法（上）》回去復(fù)習(xí)哦~那這篇們繼續(xù)總結(jié)學(xué)習(xí)吧~

   常見問題一、Western blot實驗結(jié)果中雜帶較多

   原因1： 目的蛋白有多個修飾位點(diǎn)，如磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙酰化位點(diǎn)等，本身可以呈現(xiàn)多條帶；

   解決方法：WB實驗前查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。

   原因2：實驗檢測的目的蛋白有其它剪切本；

   解決方法：查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。

   原因3：樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解；

   解決方法：WB檢測的蛋白樣本加入蛋白酶抑制劑同時樣本處理時在冰上操作。

   原因4：上樣量過高，太敏感；

   解決方法：盡量減少上樣量，注意觀察。

   原因5：一抗不純或特異性不高；

   解決方法：純化抗體，或者重新選擇或制備高特異性的抗體。

   原因6：一抗或者二抗?jié)舛绕撸?/span>

   解決方法：降低一抗、二抗?jié)舛取?br/>

   常見問題二、Western blot實驗結(jié)果中條帶大小與理論值位置不符

   原因1：Marker指示大小偏差；

   解決方法：WB實驗中選擇合適的預(yù)染Marker，并與非預(yù)染Marker 對比，觀察差異大小。

   原因2：瓊脂糖凝膠電泳體系影響；

   解決方法：避免邊緣孔的不穩(wěn)定因素，在中間孔上樣，邊緣孔加入等量上樣緩沖液平衡體系。

   原因3：翻譯后修飾；

   解決方法：查閱文獻(xiàn)，確認(rèn)蛋白本身是否存在磷酸化或糖基化等修飾。

   原因4：翻譯后剪切及異構(gòu)體；

   解決方法：查閱文獻(xiàn)，確認(rèn)蛋白是否存在多種剪切活性形式。

   原因5：蛋白多聚體形成；

   解決方法：蛋白二聚體或多聚體形成，在樣本制備過程中，使用新鮮的DTT或β-巰基乙醇，保持蛋白單體狀態(tài)。

   原因6：蛋白相對電荷變化；

   解決方法：蛋白氨基酸組成不同，某些蛋白所帶電荷未能被帶負(fù)電的SDS所覆蓋，導(dǎo)致蛋白遷移率與蛋白大小不成正比。

   OK，Western blot實驗常見問題原因以及解決方法中篇就我們就總結(jié)完咯，禿頭小寶貝們學(xué)會了嗎？希望能幫到在實驗室埋頭苦干的實驗人員，想要詳細(xì)學(xué)習(xí)實驗操作方法的好學(xué)者們可點(diǎn)擊《Western Blot實驗理論+實操》觀看學(xué)習(xí)哦！

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