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   常見(jiàn)問(wèn)題 ：一、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果中背景較高

   原因1： 膜封閉不夠，封閉不充分或封閉液不合適；

   解決方法：WB檢測(cè)前選擇更加合適的封閉液，并適當(dāng)延長(zhǎng)優(yōu)化封閉條件時(shí)間與溫度。

   原因2：一抗稀度不合適、孵育溫度過(guò)高；

   解決方法：對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇最合適的抗體稀釋度，可以4℃結(jié)合過(guò)夜。

   原因3：抗體孵育濃度過(guò)高，孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

   解決方法：優(yōu)化或適當(dāng)降低減少抗體孵育濃度與時(shí)間。

   原因4：洗滌不充分；

   解決方法：洗滌次數(shù)和時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。

   原因5：二抗非特異性結(jié)合；

   解決方法： 設(shè)置二抗對(duì)照，并選擇合適的二抗試劑。

   原因6：膜在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中干過(guò)（干膜）；

   解決方法：整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中保持膜濕潤(rùn)狀態(tài).

   原因7：蛋白質(zhì)免疫印跡轉(zhuǎn)膜過(guò)程中膜污染；

   解決方法：操作過(guò)程保持膜整潔，不要用手按壓膜的任何部位，不要讓膜接觸帶其他不干凈的器材。

   原因8：發(fā)光底物過(guò)度殘留；

   解決方法：吸干多余發(fā)光液后進(jìn)行顯影。

   原因9：顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；

   解決方法：壓膠片的時(shí)間要長(zhǎng)短適中，減少曝光時(shí)間，在顯影液中不要停留太長(zhǎng)或太短時(shí)間。

   常見(jiàn)問(wèn)題 ：二、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果中無(wú)目的條帶

   原因1：樣本中所含目的蛋白表達(dá)量過(guò)低或無(wú)表達(dá)；

   解決方法：首先確認(rèn)WB實(shí)驗(yàn)前期制備的蛋白樣本可行性，對(duì)表達(dá)過(guò)低的樣本進(jìn)行富集后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；更換超敏ECL并適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間。

   原因2：Western Blot蛋白提取時(shí)降解；

   解決方法：蛋白提取時(shí)，保持低溫狀態(tài)，并加入相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。

   原因3：蛋白樣本保存條件不合適，蛋白降解；

   解決方法：蛋白樣本加入上樣緩沖液煮沸變性后保存，對(duì)于稀有樣本建議分裝于-80℃保存，避免反復(fù)凍融，盡快完成檢測(cè)。

   原因4：蛋白轉(zhuǎn)膜效率低；

   解決方法：麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)膜體系是否正常。

   原因5：一抗二抗檢測(cè)體系不匹配；

   解決方法：WB檢測(cè)前選擇合適的一抗二抗。

   原因6：抗體失活；

   解決方法：正確保存抗體。

   原因7：顯影液使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；

   解決方法：使用新鮮試劑，并避光保存。

   好啦，Western blot實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題原因以及解決方法上篇就先介紹到這里啦，欲知后事如何，且聽(tīng)下回分解！是不是很詳細(xì)全面呢？想要詳細(xì)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)操作方法的好學(xué)者們可點(diǎn)擊《Western Blot實(shí)驗(yàn)理論+實(shí)操》觀看學(xué)習(xí)哦！

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