Western blot檢測實驗常見問題原因及解決方法（下）
2022-03-03 13:39:04
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
Western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡）實驗操作常見問題原因及由普拉特澤生物旗下生物科研培訓(xùn)品牌《春風(fēng)學(xué)院》總結(jié)分享，我們提供線上WB檢測實操視頻培訓(xùn)和線下WB實驗外包服務(wù)，擁有自己的實驗室與優(yōu)秀的技術(shù)團隊，真實值得信賴。
前兩篇我們總結(jié)了Western blot實驗結(jié)果中背景較高、無目的條帶、中雜帶較多、條帶大小與理論值位置不符等常見問題，今天來學(xué)習(xí)WB實驗操作時最容易碰見的最后一些問題吧，希望大家引以為鑒，能夠避免這些普拉特澤為大家踩過的坑。
上篇：Western blot檢測實驗常見問題原因以及解決方法（上）
中篇：Western blot檢測實驗常見問題原因以及解決方法（中）
鏈接奉上，大家快點踩著春風(fēng)學(xué)院的肩膀去摘蘋果吧！那現(xiàn)在我們來接著總結(jié)：
常見問題一、Western blot實驗結(jié)果中無信號或顯示信號弱
原因1：WB檢測樣本不表達(dá)目的蛋白；
解決方法：選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。
原因2：WB檢測樣本低表達(dá)目的蛋白；
解決方法：提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑，或跟著春風(fēng)學(xué)院的WB實操視頻教程一起操作~
原因3：轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移；
解決方法：可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠(考馬斯亮藍(lán))后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭，適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流。
原因4：抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白；
解決方法：購買抗體前應(yīng)當(dāng)查閱文獻(xiàn)結(jié)合自己的蛋白樣本認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應(yīng)蛋白。
原因5：二抗與一抗不匹配；
解決方法：Western blot實驗前查閱文獻(xiàn)，選擇針對一抗來源的種屬的抗體。
原因6：wb洗膜過度；
解決方法：洗膜時間不要太長，適當(dāng)減少，加入的去垢劑不要過強或過多。
常見問題二、Western blot實驗結(jié)果其它問題
問題1：反影或膜上可見黃色條帶；
解決方法：一抗二抗抗體濃度過高或樣本上樣量過大，導(dǎo)致酶被瞬間消耗。
問題2：轉(zhuǎn)膜后白色空點；
解決方法：轉(zhuǎn)膜三明治制備時有氣泡，轉(zhuǎn)膜時將氣泡排除干凈，或者抗體孵育不均勻，應(yīng)在搖床上孵育。
問題3：WB檢測結(jié)果中有黑色斑點背景；
解決方法：封閉液顆粒殘留，在使用前應(yīng)充分?jǐn)嚢柚辆鶆蛉芙狻?/span>
問題4：條帶拖尾；
解決方法：樣品內(nèi)有不溶物，離心或者優(yōu)化樣本蛋白提取；上樣量過載，降低上樣量；使用凝膠濃度不合適，蛋白分辨率較低，調(diào)整交聯(lián)劑比例；電泳液反復(fù)使用多次，重新配置新鮮電泳液。
問題5：條帶粘連，無孔間間隙；
解決方法：膠沒凝好，蛋白上樣量過大，適當(dāng)降低蛋白上樣量。
問題6：條帶顯白色（反白）；
解決方法：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕?，適當(dāng)降低一抗的濃度。
問題7：蛋白分子量偏低或偏高
解決方法：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。
好了，到此為止Western blot實驗所有的常見問題原因以及解決方法我們就總結(jié)完了，禿頭小寶貝們學(xué)會了嗎？撥開蛋白質(zhì)免疫印跡實驗的的層層迷霧，也沒有那么復(fù)雜和困難是不是，想要詳細(xì)學(xué)習(xí)實驗操作的同學(xué)們可點擊《Western Blot實驗理論+實操》觀看學(xué)習(xí)哦！
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