Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)常見問題原因及解決方法（上）
2022-03-01 15:22:46
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
Western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡）實(shí)驗(yàn)操作的常見問題原因與解決辦法由普拉特澤生物旗下生物科研培訓(xùn)品牌《春風(fēng)學(xué)院》對(duì)數(shù)千例WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分析后總結(jié)分享，分為上、中、下三個(gè)部分為大家詳細(xì)講解，文章末更有Western Blot實(shí)驗(yàn)理論+實(shí)操視頻課程參考學(xué)習(xí)。普拉特澤生物提供線下WB檢測(cè)培訓(xùn)及各類生物實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，是您生物科研路上的好盟友哦！
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常見問題 ：一、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果中背景較高
原因1： 膜封閉不夠，封閉不充分或封閉液不合適；
解決方法：WB檢測(cè)前選擇更加合適的封閉液，并適當(dāng)延長(zhǎng)優(yōu)化封閉條件時(shí)間與溫度。
原因2：一抗稀度不合適、孵育溫度過高；
解決方法：對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇最合適的抗體稀釋度，可以4℃結(jié)合過夜。
原因3：抗體孵育濃度過高，孵育時(shí)間過長(zhǎng)
解決方法：優(yōu)化或適當(dāng)降低減少抗體孵育濃度與時(shí)間。
原因4：洗滌不充分；
解決方法：洗滌次數(shù)和時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。
原因5：二抗非特異性結(jié)合；
解決方法： 設(shè)置二抗對(duì)照，并選擇合適的二抗試劑。
原因6：膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過（干膜）；
解決方法：整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程中保持膜濕潤(rùn)狀態(tài).
原因7：蛋白質(zhì)免疫印跡轉(zhuǎn)膜過程中膜污染；
解決方法：操作過程保持膜整潔，不要用手按壓膜的任何部位，不要讓膜接觸帶其他不干凈的器材。
原因8：發(fā)光底物過度殘留；
解決方法：吸干多余發(fā)光液后進(jìn)行顯影。
原因9：顯影時(shí)間過長(zhǎng)；
解決方法：壓膠片的時(shí)間要長(zhǎng)短適中，減少曝光時(shí)間，在顯影液中不要停留太長(zhǎng)或太短時(shí)間。
常見問題 ：二、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果中無目的條帶
原因1：樣本中所含目的蛋白表達(dá)量過低或無表達(dá)；
解決方法：首先確認(rèn)WB實(shí)驗(yàn)前期制備的蛋白樣本可行性，對(duì)表達(dá)過低的樣本進(jìn)行富集后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；更換超敏ECL并適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間。
原因2：Western Blot蛋白提取時(shí)降解；
解決方法：蛋白提取時(shí)，保持低溫狀態(tài)，并加入相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。
原因3：蛋白樣本保存條件不合適，蛋白降解；
解決方法：蛋白樣本加入上樣緩沖液煮沸變性后保存，對(duì)于稀有樣本建議分裝于-80℃保存，避免反復(fù)凍融，盡快完成檢測(cè)。
原因4：蛋白轉(zhuǎn)膜效率低；
解決方法：麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)膜體系是否正常。
原因5：一抗二抗檢測(cè)體系不匹配；
解決方法：WB檢測(cè)前選擇合適的一抗二抗。
原因6：抗體失活；
解決方法：正確保存抗體。
原因7：顯影液使用時(shí)間過長(zhǎng)；
解決方法：使用新鮮試劑，并避光保存。
好啦，Western blot實(shí)驗(yàn)常見問題原因以及解決方法上篇就先介紹到這里啦，欲知后事如何，且聽下回分解！是不是很詳細(xì)全面呢？想要詳細(xì)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)操作方法的好學(xué)者們可點(diǎn)擊《Western Blot實(shí)驗(yàn)理論+實(shí)操》觀看學(xué)習(xí)哦！
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