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雙熒光素酶報告基因實驗操作注意事項由普拉特澤生物分子檢測平臺與《春風學院》給大家總結分享，文尾附上視頻教程供大家學習。《春風學院》為普拉特澤生物旗下唯一的科研培訓品牌，為廣大科研人員提供線上下6大國自然專題精講、15項常用實驗技能講解與實操培訓課程。同時，普拉特澤生物更承接線下雙熒光素酶報告基因檢測等各類生物實驗外包服務，鋪平你的科研路~

好了話不多說我們詳細看看，雙熒光素酶檢測實操過程中有哪些注意事項！

1、報告基因檢測受多種因素影響(載體狀態(tài)細胞狀態(tài)、轉染量、轉染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等)，因此同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動。所以實驗一般需要做3個或者3個以上復孔，并且引入另一個報告基因作為內參。

2、細胞培養(yǎng)時間不宜過長，12-36h內最好;長時間培養(yǎng)后，細胞難裂解。

3、雙熒光素酶報告基因的載體選擇：

（1）螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4的載體或自己構建相應的載體;

（2）海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4代載體或自己構建相應的載體。建議海腎載體不使用強啟動子(如SV40、CMV)，而選用中等強度的啟動子(如TK)。

4、雙熒光素酶報告基因的載體比例:根據(jù)實驗具體情況調整。建議作一個預實驗來調整(董火蟲載體與海腎載體比例分別用1:101:201:501:100)，黃火蟲熒光素酶檢測發(fā)光值大于海腎

熒光素酶發(fā)光值的比例較好。

5、最適反應溫度室溫(20-22℃)。各個組分(細胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等)都需要調整到室溫。

6、雙熒光素酶反應體積:20uL(細胞裂解產(chǎn)物)-100uL(黃火蟲熒光素酶底物)-100uL(海腎熒光素酶底物)，底物量可根據(jù)實際情況調整，但一定要保證底物過量，不然會造成檢測結果出現(xiàn)大的偏差。

7、細胞裂解產(chǎn)物存放：常溫不超過6小時；-20℃一個月；-80℃半年

8、裂解產(chǎn)物與底物混合(手動加樣):要求混合快速、混合時間一致，避免熒光素酶衰變的影響。

9、發(fā)光半衰期：

（1）單熒光素酶檢測試劑盒(E1500)，螢火蟲熒光素酶的發(fā)光半衰期約12 min

（2）雙熒光素酶檢測試劑盒(E1910)，黃火蟲熒光素酶的發(fā)光半衰期約9 min，海腎熒光素酶的發(fā)光半衰期約2 min

10、檢測結果：

檢測前應檢測引板或空管的發(fā)光值，作為儀器發(fā)光背景值，Modulus多功能檢測儀的儀器背景值應小于100；樣品檢測發(fā)光值應該遠大于儀器背景值，例如10000。如果樣品發(fā)光值過于接近儀器背景值，說明樣品中熒光素酶過少，需要考慮轉染量、轉染效率、裂解效率等因素。

好啦，關于雙熒光素酶實驗的注意事項我們就講完啦，還有不懂的同學歡迎隨時留言哦，需要視頻教程的同學請點擊：《雙熒光素酶原理+實操》

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