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   雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/a>操作步驟由普拉特澤生物旗下科研培訓品牌《春風學院》為大家總結(jié)分享，從樣本制備、與雙報告基因檢測兩個方面給大家詳細解說，普拉特澤承接包括雙熒光素酶實驗線下生物實驗外包服務(wù)，同時春風學院也提供線上下生物醫(yī)學實驗技能培訓，鑄就廣大實驗人員醫(yī)學科研的金身。

   一、樣品準備

   1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞

（1）細胞鋪板:將細胞按50%的密度接種到細胞培養(yǎng)12孔板內(nèi)。

（2）轉(zhuǎn)染:16h左右細胞約70%時轉(zhuǎn)染黃光素酶報告基因質(zhì)粒，每個樣品設(shè)置3個復孔。首先設(shè)計四組:

空白組（轉(zhuǎn)染試劑+細胞）

質(zhì)粒組

質(zhì)粒+miRNA NC組

質(zhì)粒+miRNA mimics組
    2、其他準備工作

（1）配制質(zhì)粒組:按照每空50ng質(zhì)粒，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，標記為A。

（2）配制miRNANC/mimics:miRNANC/mimics的終濃度為20 nM，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，分別標記為B、C。

（3）配制對應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑:按照每孔05ulL轉(zhuǎn)染試劑同時每孔20uL無血清培養(yǎng)基計算需用量，標記為D。稀釋好的四組試劑常溫孵育5 min。

（4）將稀釋好的質(zhì)粒DNA和miRNAmimics分別和對應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20 min。

（5）將上一步中試劑對應(yīng)加入孔中。

（6）轉(zhuǎn)染6h后，換新鮮完全培養(yǎng)基。

   二、雙報告基因檢測

（1）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36-48h后，棄去培養(yǎng)基，用100uL1XPBS清洗細胞。

（2）傾斜12孔板，吸干剩余的PBS。

（3）離子水將5XPLB(裂解液)稀釋成1XPLB(現(xiàn)配現(xiàn)用)，使用前放到常溫。

（4）每孔加50uL稀釋好的1XPLB，置搖床振搖20-30 min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。

（5）選用白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟4的上清液10uL，加入100uL預先混好的 Luciferase Assay ReagentII，2s后測數(shù)據(jù)，檢測熒光素酶反應(yīng)強度。注意此步需在避光條件下進行。

（6）測定結(jié)束后，每孔添加100uL預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數(shù)據(jù)，檢測內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度。

（7）記錄讀數(shù):每個樣品會有3個數(shù)值:RLU1-黃火蟲熒光素酶反應(yīng)強度RLU2-內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度計算兩組數(shù)據(jù)比值，即RLU1/RLU2。

（8）分析數(shù)據(jù):比較1、2組可以發(fā)現(xiàn)由于對照組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，因此檢測不到熒光素酶反應(yīng)強度。比較3.4組，由干轉(zhuǎn)染microRNAmimics進行microRNA的過表達，黃光素酶的活性降低，提示microRNA可能參與抑制靶基因的表達，需要結(jié)合定點突變等方法進一步確定 miRNA與靶基因3UTR的作用位點。

   好的，那么雙熒光素酶檢測的實驗操作步驟我們就分享完啦，還沒有學會的同學可以點擊：《雙熒光素酶原理+實操》觀看視頻教程學習哦。