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雙熒光素酶報告基因實驗簡介與原理由普拉特澤生物技術(shù)人員生物為大家總結(jié)分享，普拉特澤生物憑借承接多年的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灳毦土艘簧磉^硬的實驗操作技能，有了現(xiàn)在雙熒光素酶實驗快、技術(shù)高、周期短的分子檢測平臺，為廣大生物醫(yī)學(xué)研究者提供雙熒光素酶實驗外包等幾十種分子互作實驗外包。本文我們就從雙熒光素酶的實驗的簡介和原理來給大家詳細解釋。

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒? style=

熒光素酶（英文名稱：Luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是一種學(xué)名為Photinus pyralis的螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶。在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來自于螢光素的氧化，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。沒有熒光素酶的情況下，螢光素與氧氣反應(yīng)的速率非常慢，而鈣離子的存在常?？梢赃M一步加速反應(yīng)（與肌肉收縮的情況相似）。

雙熒光素酶報告基因用于實驗系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測，通常一個報告基因作為內(nèi)對照，使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達時雙報告基因通常用來瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞，帶有實驗報告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報告基因作為對照的第二個載體。通常實驗報告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動子，研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報告基因表達活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試不被實驗條件變化所干擾。

通過這種方法，可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實驗準確性，比如，培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別,細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。理想的雙報告基因方法應(yīng)該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度,靈敏和線性范圍對同一樣品中的兩個報告基因同時測定。

這在傳統(tǒng)的報告基因，如CATB-Gal和GUS是不可能的，由于它們測試化學(xué),處理要求所固有的局限。相反，結(jié)合螢火蟲(Photinuspyralis)和海洋腔腸(Renilla reniformis)雙熒光素酶的系統(tǒng)可滿足這些要求，在單管中完成這些測試。

雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)實驗原理為：雙螢光素酶報告基因載體上含有兩種熒光素酶基因，分別是螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因，二者沒有序列同源性，并且分別對應(yīng)各自的反應(yīng)底物，消除了實驗過程中的干擾。在檢測的過程中，由于miRNA主要作用于靶基因的3'UTR，所以將靶基因mRNA的3'UTR和定點突變靶點的片段插入至雙熒光素酶基因載體下游的多克隆位點(MCS)中，并將構(gòu)建好的重組載體質(zhì)粒與miRNA或miRNA 模擬物(miRNA mimics)共轉(zhuǎn)染到工具細胞中，檢測螢光素酶的活性變化，從而可以定量反映miRNA是否對潛在靶基因起作用。以此來確定轉(zhuǎn)染載體中是否含有miRNA的靶位點。
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