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RNA Dot Blot斑點雜交實操步驟由普拉特澤生物分子檢測平臺分享，Dot Blot分子生物學(xué)中用于檢測生物分子，檢測、分析和鑒定蛋白質(zhì)/核酸的一種技術(shù)。普拉特澤生物分子檢測平臺長期為大家提供Dot Blot實驗外包服務(wù)，以RNA為例將Dot Blot實操步驟分享給大家，一起學(xué)習(xí)吧！

一、RNA乙酰化Dot Blot實操步驟

1、實驗準(zhǔn)備

儀器準(zhǔn)備：超微量核酸分析儀、紫外交聯(lián)儀、水平脫色搖床、化學(xué)發(fā)光儀、超凈工作臺、微量移液器、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、-80℃超低溫冰箱、移液器、臺式高速冷凍離心機(jī)、反滲透超純水機(jī)、立式圓形壓力蒸汽滅菌鍋

試劑準(zhǔn)備：Trizol、氯仿、異丙醇、DEPC水、1.5 mL EP管、無水乙醇、尼龍膜(帶正電荷)、BeyoECL Plus (超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)

2、實驗步驟

（1）總RNA的提取

用NanoDrop方法檢測mRNA的純度，并稀釋成不同的濃度。

（2）RNA Dot blotting

Step1：取出待測RNA樣本，解凍后測量RNA濃度，全程冰上操作。

Step2：將樣品濃度統(tǒng)一，并在新的無酶管連續(xù)稀釋樣品并混勻，稀釋梯度不固定，可自己試試最好效果。我選擇的終濃度為400/200/100μg/μL 。

Step3：離心后，將RNA樣品95℃加熱3分鐘以破壞二級結(jié)構(gòu)，結(jié)束后立即冰上冷卻，防止重新形成二級結(jié)構(gòu)。

Step4：用1mL槍頭粗端在NC膜上留下圓形印記，以引導(dǎo)加樣，隨后將NC膜裁剪成合適的尺寸，轉(zhuǎn)移至干凈的塑料盒中。

Step5：將2μLRNA樣品按順序滴在NC膜上，注意槍頭不要碰膜，樣品應(yīng)在膜上自然擴(kuò)散，每次加樣都需要更換槍頭。

Step6：室溫下NC膜上稍干燥后可進(jìn)行RNA與膜的交聯(lián)。方法一：37℃烘箱 30 min。方法二：254 nm波長的紫外線燈下照射30 h-1h。

Step7：10 mL TBST清洗膜5 min，洗去未結(jié)合的RNA。

Step8：棄去TBST，加入10 mL封閉液，室溫?fù)u動孵育1小時。

Step9：棄去封閉液，加入含有一抗的封閉液4℃孵育過夜。

Step10：10 mLTBST清洗膜3次，每次10 min。

Step11：二抗室溫孵育1小時。

Step12：同第10步。

Step13：ECL底物孵育5 min

Step14：顯影儀下拍照

Step15：拍完照后，將膜放置于10 mL亞甲藍(lán)染色緩沖液中，室溫?fù)u動孵育30 min

Step16：用ddH2O清洗至背景大致干凈即可，約30-60 s

Step17：白光成像采集亞甲藍(lán)染色后的圖像作為負(fù)載對照。

RNA Dot Blot檢測實驗步驟就介紹完啦，希望能給到正在準(zhǔn)備Dot Blot實驗設(shè)計的您一點幫助，如果您還有什么問題或者有Dot Blot實驗外包服務(wù)，歡迎給普拉特澤留言~

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