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Dot blot斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)原理與方法【Dot Blot外包】

大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起學(xué)習(xí)新的實(shí)驗(yàn)——Dot Blot斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)。Dot Blot斑點(diǎn)雜交是指將待測的DNA變性后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜、NC膜）上，用已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，洗膜（除去未接合的探針），放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測。

Dot blot斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)介紹由普拉特澤生物分子檢測品臺總結(jié)分享，分子檢測平臺為廣大科研實(shí)驗(yàn)人員提供dot blot斑點(diǎn)雜交外包實(shí)驗(yàn)服務(wù)，先一起來學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)什么是Dot blot吧！

斑點(diǎn)雜交（Dot blot）是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。

Dot blot斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)可分為DNA、RNA和完整細(xì)胞的斑點(diǎn)雜交三類，三種方法各有不同。

1、DNA斑點(diǎn)雜交方法介紹

（1）先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

（2）將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5 min，冰中速冷。

（3）用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置，將DNA點(diǎn)樣于膜上，每個(gè)樣品一般點(diǎn)5μl(2~10μg DNA)。
（4）將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/span>

2、RNA斑點(diǎn)雜交方法介紹

RNA斑點(diǎn)雜交法與DNA斑點(diǎn)雜交方法類似，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）水，加5μl 甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。

3、完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交方法

應(yīng)用類似檢測細(xì)菌菌落的方法，可以對細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)?/span>DNA純度不夠，會產(chǎn)生高本底。

Dot blot斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)法簡單實(shí)用，適用于大樣本數(shù)同時(shí)進(jìn)行檢測，但是由于同一斑點(diǎn)位置，除了目標(biāo)核酸分子外，還存在其他成千上萬種不同的核酸分子，而這些核酸分子有可能會與探針分子部分結(jié)合，促進(jìn)探針分子與目標(biāo)核酸分子的結(jié)合，可能導(dǎo)致陽性結(jié)果放大甚至是假陽性結(jié)果，分析檢測結(jié)果是要結(jié)合實(shí)際考慮到這一點(diǎn)。

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