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大家好，今天跟普拉特澤生物一起學(xué)習(xí)的是GST pull down實(shí)驗(yàn)的操作步驟。上期咱們簡(jiǎn)單介紹了一下GST pull down實(shí)驗(yàn)，是一個(gè)近年來(lái)受廣大科研人員關(guān)注的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)，普拉特澤生物分子檢測(cè)平臺(tái)專(zhuān)業(yè)為大家提供GST pull down檢測(cè)外包服務(wù)，提供真實(shí)、高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?，F(xiàn)在我們來(lái)跟著技術(shù)來(lái)看看GST pull down實(shí)驗(yàn)的操作步驟：

一、GST-a融合蛋白的制備

1、GST-a融合蛋白的表達(dá)

(1)將目的蛋白與GST的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌株中；

(2)挑取單克隆到含有5mL LB培養(yǎng)基（加入5 μL氨芐）的10 mL試管里，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；

(3)將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500mL LB（含500 μL氨芐）的1L錐形瓶中，37℃，200 rpm培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；

(4)測(cè)定OD600值，當(dāng)OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，加入適當(dāng)濃度的IPTG，在20℃，200rpm條件下培養(yǎng)10-16h（通常需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間）；

(5)誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后，將菌液分次倒入50 mL離心管中，4℃ 4000 rpm離心10分鐘，然后棄去上清，收集管底菌體，如暫時(shí)不用，可將菌體保存于-80℃冰箱中；

(6)先加入少量PBS于離心管中，離心5-10 min后棄去上清，再按每10 mL菌液沉淀1 mL PBS的量加入相應(yīng)的PBS，渦旋振蕩，使菌體沉淀充分溶解于PBS溶液中；

(7)把混合菌體置于冰水浴中，用超聲儀進(jìn)行破碎。每次超聲破碎20 s，間隔30 s（破碎時(shí)間、破碎次數(shù)和間隔時(shí)間視具體情況而定），經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí)間超聲后，溶液會(huì)顯得澄清；

(8)將超聲后的溶液4℃ 4000 rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2、GST-a融合蛋白的純化

(1)在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積50% Glutathione Sepharose 4B，4℃搖床上緩慢搖動(dòng)30~60 min;

(2)4℃，4000rpm離心5 min，棄去上清，該Sepharose上結(jié)合了GST-a融合蛋白；

(3)加入200 μL預(yù)冷的PBS溶液，輕晃懸浮珠子，將Sepharose洗滌一次，4℃，4000 rpm離心5 min，棄去上清，重復(fù)此步驟3次；

(4)最后一次用移液槍吸走珠子表面的液體，但注意不要吸走珠子，即可獲得結(jié)合GST-a的Sepharose。

二、體外蛋白的結(jié)合

1、將結(jié)合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B懸浮在適量體積的緩沖液中，加入20 μL含有b蛋白的溶液，同時(shí)采用結(jié)合有GST蛋白的Sepharose作為陰性對(duì)照，在搖床上晃動(dòng)4-8h（4℃）；

2、4℃，4000 rpm離心5 min，棄去上清液；

3、沿壁加入200μL預(yù)冷的緩沖液對(duì)Sepharose進(jìn)行洗滌，

4、4℃，4000rpm離心5 min，棄上清，該步驟重復(fù)3次；

5、吸干Sepharose上面的液體后，加入20ul 1×蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5 min，放入-20℃冰箱備用；

6、通過(guò)SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行檢測(cè)。

好啦，那關(guān)于GST pulldown實(shí)驗(yàn)步驟就分享完啦，如果您也在設(shè)計(jì)GST pull down實(shí)驗(yàn)的話(huà)可以留言給我們跟技術(shù)一起討論設(shè)計(jì)出最好的實(shí)驗(yàn)方案哦~如果您覺(jué)得實(shí)驗(yàn)讓您頭疼的話(huà)也可以把GST pull down實(shí)驗(yàn)外包給我們，實(shí)驗(yàn)交給我，思考留給您~