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大家好，今天帶大家來認(rèn)識(shí)一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)——Northern Blot印跡雜交實(shí)驗(yàn)，考慮到上期出了Western Blot之后總有小姐姐來向小編咨詢Northern Blot的各種實(shí)驗(yàn)問題，居然還有朋友連概念都是模糊的，那小編當(dāng)然是即刻給安排上啦！Northern Blot實(shí)驗(yàn)介紹由普拉特澤生物分子檢測(cè)平臺(tái)給大家總結(jié)分享，普拉特則專業(yè)提供Northern Blot外包實(shí)驗(yàn)服務(wù)，分子檢測(cè)平臺(tái)成立以來承接了Northern Blot業(yè)務(wù)幾百次，積累了極其豐富實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，快來學(xué)習(xí)吧！

Northern Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖片來源《Feedback inhibition of L1 and alu retrotransposition through altered double strand break repair kinetics》

Northern印跡雜交（Northern blot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。（鏈接奉上快去學(xué)習(xí)）

Northern Blot印跡雜交的實(shí)驗(yàn)原理是：整合到植物染色體上的外源基因如果能正常表達(dá)，則轉(zhuǎn)化植株細(xì)胞內(nèi)有其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——特異mRNA的生成。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，則不同的RNA分子將按分子質(zhì)量大小依次排布在凝膠上；將他們?cè)晦D(zhuǎn)移到固定膜上；在適宜的離子強(qiáng)度及溫度條件下，用探針與膜雜交；然后通過探針的標(biāo)記性質(zhì)檢測(cè)出雜交體。若經(jīng)雜交，樣品無雜交帶出現(xiàn)，表明外源基因已經(jīng)整合到植物細(xì)胞染色體上，但在該取材部位及生理狀態(tài)下該基因并未有效表達(dá)。

Northernblot的優(yōu)勢(shì)在于它可檢測(cè)目的片段的大小、是否具有可變剪切出現(xiàn)、可允許探針的部分不配對(duì)性，雜交過后的膜經(jīng)過一定的處理除去探針后還可保存很長時(shí)間再次雜交使用。

那么為什么northern見的比較少呢？

因?yàn)閷?shí)驗(yàn)需要的RNA量比較大，對(duì)一些少量和痕量樣品是很難實(shí)現(xiàn)的，因此很多實(shí)驗(yàn)都做反轉(zhuǎn)錄后的定量分析。但事實(shí)上除了無法給出realtimePCR那種量化數(shù)據(jù)外（realtimePCR，尤其是間接法的，做過的人應(yīng)該有個(gè)概念吧，你標(biāo)準(zhǔn)曲線稍微偏一點(diǎn)點(diǎn)，結(jié)果就有倒過來的可能），Northern的結(jié)果才是最為直接，最可信的結(jié)果，因?yàn)閏DNA的定量經(jīng)過了反轉(zhuǎn)錄這一步，由于多了一步操作因而也多了一步不確定的因素，而且由于檢測(cè)的靶由RNA調(diào)到了DNA，做PCR和雜交時(shí)結(jié)果也就會(huì)受到genomicDNA的影響（reverse-Northernblot和RT都一樣），另外在雜交實(shí)驗(yàn)中，DNA-RNA，RNA-RNA這兩種雜交雙鏈的穩(wěn)定性是比DNA-DNA穩(wěn)定和嚴(yán)格的多的，因此不管是DNA探針還是RNA探針，檢測(cè)RNA靶要比檢測(cè)DNA靶在嚴(yán)謹(jǐn)性上要高很多。因此Northern Blot在材料和技術(shù)上的問題沒辦法做，所以在通過反轉(zhuǎn)錄做cDNA。

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