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免疫組化（IHC）染色常見問題及其解決方法上【附視頻教程】

今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是免疫組化（IHC）常見問題及其解決方法。免疫組化（IHC）染色是一項基礎(chǔ)研究實驗，雖然其總體實驗難度較低，但是忽略的細(xì)節(jié)容易讓結(jié)果出現(xiàn)各種各樣的問題。今天病理平臺的技術(shù)就跟大家來盤一盤，我們承接免疫組化/IHC代做時出現(xiàn)過的問題及其解決方法?？偸怯龅礁鞣N問題的實驗小白可以學(xué)習(xí)閃避很多實驗和各種常見問題。

免疫組化問題一：無信號-陰性結(jié)果

1、真陰性結(jié)果：組織或細(xì)胞不表達(dá)抗原，無法檢測到相應(yīng)信號;或抗原表達(dá)量太低，無法檢測到相關(guān)信號。

2、假陰性結(jié)果

（1）染色前錯誤：切片時選錯蠟塊或拿錯切片，這種情況可用H&E染色驗證。

（2）染色操作錯誤：

①確認(rèn)是否忽略了應(yīng)加的某種試劑，包括抗抗、底物等。

②確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否在足夠的溫度條件下滿足足夠的時間。

③復(fù)查抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗四配。

④檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體。

⑤檢查抗體稀釋比及所使用的抗體稀釋液是否合適。

⑥確定組織或細(xì)胞標(biāo)本的儲存條件。

⑦檢查底物溶液，最簡單的檢測方法是將一滴標(biāo)記有的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些

底物在制成工作液后應(yīng)在一定時間內(nèi)用完，否則會失效。

⑧檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，沖洗液的pH值也很重要，與過氧化物酶底物適配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。

⑨檢查復(fù)染、脫水、透明和封片劑是否和所使用的色原匹配。熒光素染色封片要選用水溶性封片劑，AEAPRed/FastRed和其它水溶性染料不能用二甲苯有機溶劑透明。

免疫組化-普拉特澤生物

問題二：信號弱一弱陽性結(jié)果

如果陰性對照沒有染色而陽性對照標(biāo)本陽性強度較弱，除了考慮上述因素外，還應(yīng)考慮：

1、標(biāo)本的固定方式：固定劑不適當(dāng)，固定時間過長或過短，固定溫度過高，都會影響到所檢測的抗原數(shù)量和質(zhì)量。

2、抗原修復(fù)方式不當(dāng)：由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，大部分抗體在做免疫組化時需用抗原熱修復(fù)或酶消化等方法使抗原暴露，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照試劑生產(chǎn)廠家的說明，同時結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定。同時亦須注意，小部分抗體在進行免疫組化實驗時是不需要進行抗原修復(fù)操作的，如果進行了抗原修復(fù)操作反而可能會使陽性著色減弱。

3、第一抗體效價太低或被過度稀釋，或者孵音的溫度/時間不合適也可導(dǎo)致弱陽性結(jié)果。一般試劑生產(chǎn)廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出最佳的使用濃度。

4、切片上如遺留了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。

5、孵育時切片是否水平放置，否則會導(dǎo)致抗體流失。

好了，免疫組化的常見問題及其解決方法上篇咱們就講完啦，想要深入學(xué)習(xí)的朋友可以點擊《免疫組化/IHC 理論+實操》來學(xué)習(xí)理論和實操，還有更多的免疫組化常見問題我們來看看《免疫組化/IHC常見問題及其解決方法（下）》，也歡迎大家留言分享自己在做免疫組化實驗時遇到的問題和摸索出來的解決方法分享學(xué)習(xí)哦，咱們下篇見！

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