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酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)步驟由普拉特澤生物技術(shù)跟大家總結(jié)分享，酵母雙雜交系統(tǒng)正是利用了GAL4的功能特點(diǎn)，通過兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì)。普拉特澤生物——分子檢測(cè)平臺(tái)專業(yè)承接酵母雙雜實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)，今天技術(shù)就跟大家來分享實(shí)驗(yàn)的操作步驟，一起來學(xué)習(xí)吧！

一、構(gòu)建重組Activation Domain（AD）融合的重組質(zhì)粒（pGADT7載體）以及Binding Domain（BD）融合的重組質(zhì)粒（pGBKT7載體）；

二、雙向酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白質(zhì)間的相互作用

1、酵母轉(zhuǎn)化中DNA 混合液的配制

在制備酵母感受態(tài)的過程中配制下面的DNA 轉(zhuǎn)化混合液（1×）：

2、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備以及共轉(zhuǎn)化，下面是所需用量為10 個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備。

（1）挑取平板上AH109 酵母細(xì)胞的單個(gè)克隆至5 mL YPD 培養(yǎng)基中，30℃，搖床振搖培養(yǎng)過夜（可加入2 mg/mL的Adenine 75 μL使酵母生長(zhǎng)速度加快）；

（2）轉(zhuǎn)接2.5 mL過夜培養(yǎng)的菌液至50 mL YPD 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約3-4 h（OD600~2-4）；

（3）用50 mL的離心管收菌，4,500 rpm，3 min ，棄上清；

（4）加入20 mL 無菌水洗滌，同樣條件離心，棄上清；

（5）用1 mL 無菌水重懸菌液，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP 管中；

（6）最高速短時(shí)離心15 Sec；棄上清；

（7）加入450 μL LiAc (0.1 M) 重懸菌體，30℃搖床振搖培養(yǎng)15 min；

（8）分裝50 μL/管至EP 管中；

（9）最高速短時(shí)離心15 Sec；棄上清；

（10）每管加入已經(jīng)配制好的DNA 轉(zhuǎn)化混合液（可加入40 μL DMSO 以提高轉(zhuǎn)化效率），徹底重懸細(xì)胞，30℃搖床振搖培養(yǎng)45 min；

（11）轉(zhuǎn)移至42℃水浴20 min；

（12）冰上放置3 min；

（13）最高速短時(shí)離心30 Sec；棄上清；

（14）加入100 μL 無菌水重懸菌體，涂布于SCM/-2(缺少色氨酸和亮氨酸的酵母合成培養(yǎng)基)氨基酸缺陷型平板上。30℃恒溫箱倒置培養(yǎng)3 天后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

3、酵母雙雜系統(tǒng)相互作用的篩選

（1） 3 天后，在轉(zhuǎn)化后的平板上各挑取四個(gè)單菌落，分別劃線于SCM/-2、SCM/-3 (缺少色氨酸、亮氨酸和組氨酸的酵母合成培養(yǎng)基) 和SCM/-4 (缺少色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤的酵母合成培養(yǎng)基)氨基酸缺陷型平板上，30℃恒溫箱倒置培養(yǎng)3 天后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

（2）如果菌落能在SCM/-4 平板上正常生長(zhǎng)，說明AD-fusion 和BD-fusion兩者之間有強(qiáng)的相互作用；如果不能在SCM-4 平板上正常生長(zhǎng)但是能在SCM/-3平板上正常生長(zhǎng)，則有弱的相互作用；如果在SCM/-4 和SCM/-3 平板上均不能生長(zhǎng)而只能在SCM/-2 平板上生長(zhǎng)，則無相互作用。

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