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        今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是免疫組化（IHC）常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方法。免疫組化（IHC）染色是一項(xiàng)基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)，雖然其總體實(shí)驗(yàn)難度較低，但是忽略的細(xì)節(jié)容易讓結(jié)果出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題。今天病理平臺(tái)的技術(shù)就跟大家來(lái)盤一盤，我們承接免疫組化/IHC代做時(shí)出現(xiàn)過(guò)的問(wèn)題及其解決方法。總是遇到各種問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)小白可以學(xué)習(xí)閃避很多實(shí)驗(yàn)和各種常見(jiàn)問(wèn)題。

        免疫組化問(wèn)題一：無(wú)信號(hào)-陰性結(jié)果

        1、真陰性結(jié)果：組織或細(xì)胞不表達(dá)抗原，無(wú)法檢測(cè)到相應(yīng)信號(hào);或抗原表達(dá)量太低，無(wú)法檢測(cè)到相關(guān)信號(hào)。

        2、假陰性結(jié)果

        （1）染色前錯(cuò)誤：切片時(shí)選錯(cuò)蠟塊或拿錯(cuò)切片，這種情況可用H&E染色驗(yàn)證。

        （2）染色操作錯(cuò)誤：

        ①確認(rèn)是否忽略了應(yīng)加的某種試劑，包括抗抗、底物等。

        ②確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否在足夠的溫度條件下滿足足夠的時(shí)間。

        ③復(fù)查抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測(cè)系統(tǒng)是否和一抗四配。

        ④檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體。

        ⑤檢查抗體稀釋比及所使用的抗體稀釋液是否合適。

        ⑥確定組織或細(xì)胞標(biāo)本的儲(chǔ)存條件。

        ⑦檢查底物溶液，最簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法是將一滴標(biāo)記有的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些

底物在制成工作液后應(yīng)在一定時(shí)間內(nèi)用完，否則會(huì)失效。

        ⑧檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，沖洗液的pH值也很重要，與過(guò)氧化物酶底物適配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。

        ⑨檢查復(fù)染、脫水、透明和封片劑是否和所使用的色原匹配。熒光素染色封片要選用水溶性封片劑，AEAPRed/FastRed和其它水溶性染料不能用二甲苯有機(jī)溶劑透明。

      問(wèn)題二：信號(hào)弱一弱陽(yáng)性結(jié)果

        如果陰性對(duì)照沒(méi)有染色而陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本陽(yáng)性強(qiáng)度較弱，除了考慮上述因素外，還應(yīng)考慮：

        1、標(biāo)本的固定方式：固定劑不適當(dāng)，固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，固定溫度過(guò)高，都會(huì)影響到所檢測(cè)的抗原數(shù)量和質(zhì)量。

        2、抗原修復(fù)方式不當(dāng)：由于石蠟切片在制作的過(guò)程中固定劑對(duì)抗原的封閉作用，大部分抗體在做免疫組化時(shí)需用抗原熱修復(fù)或酶消化等方法使抗原暴露，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照試劑生產(chǎn)廠家的說(shuō)明，同時(shí)結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定。同時(shí)亦須注意，小部分抗體在進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)是不需要進(jìn)行抗原修復(fù)操作的，如果進(jìn)行了抗原修復(fù)操作反而可能會(huì)使陽(yáng)性著色減弱。

        3、第一抗體效價(jià)太低或被過(guò)度稀釋，或者孵音的溫度/時(shí)間不合適也可導(dǎo)致弱陽(yáng)性結(jié)果。一般試劑生產(chǎn)廠家都會(huì)對(duì)試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來(lái)自各種組織，處理過(guò)程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對(duì)所使用的一抗進(jìn)行梯度測(cè)試，找出最佳的使用濃度。

        4、切片上如遺留了過(guò)多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時(shí)，等于人為地對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。

        5、孵育時(shí)切片是否水平放置，否則會(huì)導(dǎo)致抗體流失。

        好了，免疫組化的常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方法上篇咱們就講完啦，想要深入學(xué)習(xí)的朋友可以點(diǎn)擊《免疫組化/IHC 理論+實(shí)操》 來(lái)學(xué)習(xí)理論和實(shí)操，還有更多的免疫組化常見(jiàn)問(wèn)題我們來(lái)看看《免疫組化/IHC常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方法（下）》，也歡迎大家留言分享自己在做免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)遇到的問(wèn)題和摸索出來(lái)的解決方法分享學(xué)習(xí)哦，咱們下篇見(jiàn)！