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常見的蛋白互作研究方法有哪些呢？

本篇文章為大家整理了15種蛋白互作研究方法，快來看看吧~

一、融合蛋白沉降技術(shù)（Pull-down）

原理：通過磁珠/瓊脂糖填料固定帶有標(biāo)記的“誘餌”蛋白，從細(xì)胞裂解液、純化蛋白或表達(dá)系統(tǒng)中捕獲“獵物”蛋白，然后將復(fù)合物蛋白分離后進(jìn)行凝膠或質(zhì)譜分析，從而確認(rèn)互作蛋白的“身份”。

優(yōu)點(diǎn)：不僅能證實(shí)靶蛋白的直接相互作用，且洗脫條件也很溫和，保留蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與天然蛋白復(fù)合體的同時(shí)，又避免將非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)共同洗脫下來，確保了后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。

缺點(diǎn)：易出現(xiàn)假陽性；不能夠完全反映細(xì)胞內(nèi)蛋白真實(shí)互作的狀態(tài)；融合表達(dá)的GST標(biāo)簽，肽鏈較長，可能會改變原目的蛋白的原有的折疊結(jié)構(gòu)。

二、串聯(lián)親和純化技術(shù)（TAP）
原理：傳統(tǒng)的TAP標(biāo)簽蛋白由Protein A、TEV蛋白酶可剪切序列和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）組成。
TAP技術(shù)通過兩步親和純化來減少非特異性蛋白結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：TAP能減少非特異性蛋白結(jié)合，還能保留蛋白復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的修飾和結(jié)合狀態(tài)。
缺點(diǎn)：需要較多的樣本材料來提取蛋白，價(jià)格比較昂貴，不能高效檢測到瞬時(shí)或較弱的蛋白質(zhì)相互作用。
三、生物膜干涉技術(shù)（BLI）
原理：是一種無標(biāo)記（Label-free）光學(xué)生物傳感技術(shù)，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測分析生物分子相互作用，并對其結(jié)合強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)進(jìn)行量化分析。與SPR技術(shù)不同的是，BLI技術(shù)中不使用金屬芯片，而是利用生物傳感器。將配體偶聯(lián)在傳感器的末端，浸入樣品中來捕獲分析物。優(yōu)點(diǎn)：易于使用；幾乎無堵塞，適用于復(fù)雜、粘稠的樣本；可最大限度地減小了體積效應(yīng)。缺點(diǎn)：傳感器的靈敏度比SPR和GCI傳感器低幾個(gè)數(shù)量級；確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí)，精度有限
四、表面等離子共振技術(shù)（SPR）

原理：在芯片表面固定一層生物分子識別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，會引起金膜表面折射率變化，最終導(dǎo)致SPR角變化，通過監(jiān)測SPR的角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等。

優(yōu)點(diǎn)：檢測快捷方便，應(yīng)用范圍廣、不需要標(biāo)記待測物。

缺點(diǎn)：對于樣品組成以及溫度等干擾因素比較敏感，對于非特異性吸附比較難區(qū)分。

五、光柵耦合干涉技術(shù)（GCI）

原理：基于波導(dǎo)干涉技術(shù)（另一種無標(biāo)記的光學(xué)分析方法），可以實(shí)時(shí)監(jiān)測和表征分子相互作用，并確定動(dòng)力學(xué)速率參數(shù)、親和常數(shù)以及與固定配體相互作用的分析物分子的濃度。

優(yōu)點(diǎn)：初級靈敏度，適用于無標(biāo)記的相互作用分析；無堵塞微流體；可以測量緊密結(jié)合劑和快速結(jié)合速率。

缺點(diǎn)：暫無

六、鄰近蛋白標(biāo)記技術(shù)（BioID）

原理：通過將生物素連接酶（BirA）與“誘餌”蛋白融合表達(dá)，加入適量生物素，融合蛋白的相互作用以及附近環(huán)境中的蛋白質(zhì)會被生物素化。然后通過鏈霉親和素或Strep-Tactin進(jìn)行親和純化，將被生物素化的蛋白質(zhì)從細(xì)胞裂解液中富集出來，產(chǎn)物做質(zhì)譜鑒定。

優(yōu)點(diǎn)：BiolD鑒定到的互作蛋白是細(xì)胞內(nèi)與誘餌蛋白天然互作的，符合體內(nèi)真實(shí)生理情況，可信度高；弱結(jié)合蛋白和瞬時(shí)互作蛋白也能被檢測到。

缺點(diǎn)：不能判斷鑒定到的蛋白是直接還是間接與誘餌蛋白互作的，而沒有伯胺的互作蛋白因不能被生物素化，所以無法被檢測到。

七、酵母雙雜交技術(shù)（Y2H）

原理：很多真核生物的轉(zhuǎn)錄因子由兩個(gè)有不同功能的結(jié)構(gòu)域組成，包括轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Transcriptional activationdomain，AD）和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbinding domain，BD）。轉(zhuǎn)錄因子通過BD和九、噬菌體展示技術(shù)（PDT）AD分別與DNA上的特異序列結(jié)合，從而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)點(diǎn)：簡便、易用、費(fèi)用低廉，能檢測到瞬時(shí)或較弱的蛋白質(zhì)相互作用。

缺點(diǎn)：較高的假陽性，不能真實(shí)反映蛋白質(zhì)在自身細(xì)胞中的相互作用。

八、免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）

原理：以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，也是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

優(yōu)點(diǎn)：保留蛋白質(zhì)的修飾和結(jié)合狀態(tài)，同時(shí)所需的樣本量較少。

缺點(diǎn)：Co-IP特異性較低。

九、噬菌體展示技術(shù)（PDT）

原理：在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當(dāng)噬菌體生長時(shí)，表面就表達(dá)出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合。

優(yōu)點(diǎn)：具有簡便、高通量的特點(diǎn)，可以直接評價(jià)相互結(jié)合的特異性。

缺點(diǎn)：不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá)，因部分蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、膜插入和絡(luò)合，導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時(shí)需外加選擇壓力。

十、鄰位連接技術(shù)（PLA）

原理：采用核酸適體（aptamer）或單/多克隆抗體-寡聚核苷酸復(fù)合物作為鄰位連接探針（proximity probes）。當(dāng)一對鄰位探針同時(shí)識別同一個(gè)目標(biāo)蛋白分子（一個(gè)蛋白復(fù)合體中的兩個(gè)蛋白）時(shí)，它們將在空間位置上相互臨近，通過連接反應(yīng)形成可擴(kuò)增的DNA標(biāo)簽序列，該標(biāo)簽序列能夠反映待測蛋白的表達(dá)及互作情況。

優(yōu)點(diǎn)：可識別同一目標(biāo)的兩個(gè)不同抗原表位，靈敏度和精確度遠(yuǎn)高于單個(gè)表位識別；通過一對鄰位探針環(huán)化并且進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，更有利于信號的放大；可以憑借探針錨定目標(biāo)蛋白，從而準(zhǔn)確地定位目標(biāo)；可以捕獲瞬時(shí)的相互作用和低豐度蛋白的相互作用。

缺點(diǎn)：暫無一

十一、NanoBiT 蛋白互補(bǔ)技術(shù)

原理：利用兩個(gè)特定的互補(bǔ)蛋白質(zhì)片段，在相互作用后形成一個(gè)完整的蛋白質(zhì)復(fù)合物。其中，一個(gè)蛋白質(zhì)片段被稱為“受體”，另一個(gè)蛋白質(zhì)片段被稱為“配體”。當(dāng)兩個(gè)互補(bǔ)的蛋白質(zhì)片段相互接近時(shí)，它們會通過非共價(jià)相互作用結(jié)合在一起，形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物。

優(yōu)點(diǎn)：高度特異性、強(qiáng)大的親和力以及靈活的應(yīng)用。

缺點(diǎn)：早期需要摸索LgBiT和SmBiT構(gòu)建在不同的N端或C端的組合。

十二、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)

原理：以蛋白質(zhì)分子作為配基（探針蛋白），將其有序地固定在固相載體（滴定板、濾膜、玻璃片等）的表面形成微陣列；用帶有熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)（或其它分子）與之作用，經(jīng)漂洗將未結(jié)合的成分洗去，經(jīng)熒光掃描等監(jiān)測方式測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。然后通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系。

優(yōu)點(diǎn)：具有微量化、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)；樣品要求低，可直接對不經(jīng)處理的各種體液和分泌物進(jìn)行檢測。

缺點(diǎn)：成本過高，需一系列昂貴的精密儀器；芯片的標(biāo)準(zhǔn)化問題。

十三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）

原理：在兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)（如供體熒光基團(tuán)“CFP”和受體熒光基團(tuán)“YFP”）在足夠靠近時(shí)，供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。

優(yōu)點(diǎn)：能檢測到瞬時(shí)、較弱的蛋白質(zhì)相互作用，以及倆蛋白的細(xì)胞分布和作用位點(diǎn)。

缺點(diǎn)：光譜可能存在重疊，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

十四、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BIFC）

原理：熒光蛋白可從特定的位點(diǎn)被分開，產(chǎn)生兩個(gè)非熒光活性片段。當(dāng)兩片段分別被融合到相互作用的蛋白上時(shí)，會因蛋白的相互作用力而被拉近、發(fā)生互補(bǔ)從而重新構(gòu)建成有活性的熒光蛋白并在激發(fā)光下產(chǎn)生熒光。因此可以直接通過觀察熒光有無來判斷蛋白是否發(fā)生相互作用。

優(yōu)點(diǎn)：能簡單方便地通過觀察熒光鑒定蛋白質(zhì)相互作用。

缺點(diǎn)：對溫度敏感，不能實(shí)時(shí)反應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合和分離情況。

十五、生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（BRET）

原理：一種流行的基于鄰近的檢測方法，即將一種目標(biāo)蛋白與生物發(fā)光能量供體融合，其他蛋白質(zhì)與熒光能量受體融合，可監(jiān)測活體內(nèi)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和構(gòu)象重排細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：不依賴于激發(fā)光，檢測背景低；不需要漂白，細(xì)胞損壞更少；同時(shí)也避免了自發(fā)熒光干擾。

缺點(diǎn)：需要配對的底物貴
有不懂的話可以隨時(shí)咨詢噗啦噗啦實(shí)驗(yàn)室~18570028002（微信同號）