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大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與解讀，上期我們學(xué)習(xí)了熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的操作步驟，不記得的可以點(diǎn)擊回去復(fù)習(xí)哦。普拉特澤生物表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)專業(yè)承接熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)外包與代做服務(wù)，本文我們就來(lái)一點(diǎn)一點(diǎn)看，熒光定量PCR結(jié)果到底應(yīng)該如何分析與解讀。

1、基線

基線是指實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的基線是指在PCR的初始循環(huán)期間的信號(hào)水平，通常是3至15的循環(huán)之間，此時(shí)熒光信號(hào)幾乎沒(méi)有變化。此時(shí)低信號(hào)可以認(rèn)為是背景或反應(yīng)的“噪音”。基線應(yīng)該設(shè)置應(yīng)考慮，在消除早期擴(kuò)增循環(huán)中背景的同時(shí)，不覆蓋掉明顯非背景的擴(kuò)增信號(hào)。當(dāng)比較不同的qPCR反應(yīng)或?qū)嶒?yàn)時(shí)，應(yīng)定義同一基線。

2、閾值

qPCR的閾值代表的是明顯超出基線的擴(kuò)增信號(hào)水平，用以區(qū)分明確的擴(kuò)增信號(hào)和背景。通常，qPCR儀器自帶軟件會(huì)自動(dòng)將閾值設(shè)置為基線熒光值標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

3、CT

Ct是指熒光信號(hào)超過(guò)閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。Ct值與目的基因的起始量成反比，可用于計(jì)算DNA初始拷貝數(shù)。隨著模板量減少，檢測(cè)到顯著擴(kuò)增時(shí)的循環(huán)數(shù)會(huì)增加。

4、擴(kuò)增曲線

擴(kuò)增曲線早期循環(huán)中，熒光信號(hào)幾乎沒(méi)有變化。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，每個(gè)循環(huán)的熒光水平開(kāi)始顯著上升，被稱為指數(shù)期。一般在在指數(shù)期的早期階段而不是后期的平臺(tái)期進(jìn)行定量分析。在指數(shù)階段開(kāi)始時(shí)，所有的試劑仍然是過(guò)量的，DNA聚合酶仍然高效，并且擴(kuò)增產(chǎn)物量還較低，不會(huì)在退火時(shí)與引物競(jìng)爭(zhēng)。這些因素都有助于更準(zhǔn)確的定量。

5、溶解曲線

熔解曲線熔解曲線描繪了隨著反應(yīng)溫度升高，摻入染料分子的dsDNA解離成單鏈DNA（ssDNA）時(shí)的熒光變化。例如，當(dāng)結(jié)合SYBR? Green I染料的dsDNA被加熱時(shí)，達(dá)到解鏈溫度（Tm）后，由于雙聯(lián)DNA鏈解離而釋放出染料，熒光信號(hào)會(huì)急劇降低。以熒光信號(hào)隨時(shí)間變化作圖可得到圖3A，然后以ΔF/ΔT（熒光變化/溫度變化）值與溫度作圖，可得到熔融動(dòng)力學(xué)的清晰視圖（圖3B）?？梢愿鶕?jù)熔解曲線來(lái)判斷qPCR反應(yīng)的特異性，特異性的擴(kuò)增的溶解曲線會(huì)是一個(gè)緊密的單峰。

6、相對(duì)定量

相對(duì)定量，不像絕對(duì)量化嚴(yán)格，應(yīng)用于大多數(shù)基因表達(dá)水研究。相對(duì)定量關(guān)注的并非某個(gè)基因的絕對(duì)表達(dá)量，而是同一基因在樣本間的表達(dá)差異(如實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)。結(jié)果以處理組相對(duì)于未處理組的表達(dá)差異倍數(shù)表示。這種分析方法不需要測(cè)定精確的拷貝數(shù)，重點(diǎn)是在與未處理樣品組相比的表達(dá)變化上。

相對(duì)定量算法—ΔΔCt ΔΔCt方法是比較組別間同一基因表達(dá)差異的常用方法。通過(guò)將目的基因Ct(Ct 目的)與自身內(nèi)參Ct值（Ct 內(nèi)參）進(jìn)行比較，可得到每一組別的ΔCt，再將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行計(jì)算得到ΔΔCt。ΔΔCt的大小關(guān)聯(lián)目的基因表達(dá)水平的倍數(shù)差異大小。

倍數(shù)差異 = 2–ΔΔCt

ΔCt 實(shí)驗(yàn)組 – ΔCt 對(duì)照組 = ΔΔCt

Ct 目的實(shí)– Ct 內(nèi)參實(shí) = ΔCt 實(shí)驗(yàn)組

Ct 目的對(duì)– Ct 內(nèi)參對(duì)照 = ΔCt 對(duì)照組

好啦，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么分析以及數(shù)據(jù)的意義咱們就講到這里啦，如果您還有更多的問(wèn)題，歡迎您留言跟咱們的技術(shù)一起留言討論，如果您需要熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)代做與外包的服務(wù)，請(qǐng)一定記得您生物科研路上的好盟友——普拉特澤！

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