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熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟由普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)進(jìn)步，熒光定量PCR技術(shù)作為表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)重要的實(shí)驗(yàn)手段，以成熟的技術(shù)手段專業(yè)承接熒光定量PCR代做服務(wù)，同時(shí)更積累了大量的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)，今天咱們就來跟大家一起一步一步來看，熒光定量PCR的操作步驟是怎樣的！

熒光定量PCR的操作步驟可以簡(jiǎn)單概括為：RNA 提取 → 反轉(zhuǎn)錄 → 設(shè)計(jì)引物 → Q-PCR，咱們一步一步看。

熒光定量PCR第一步：RNA提取

1、首先進(jìn)行不同樣本的預(yù)處理：

（1）組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol。

（2）全血樣品：加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。

（3）細(xì)胞樣品：懸浮液中生長(zhǎng)的細(xì)胞，通過離心收集細(xì)胞后，每1×105?106細(xì)胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲(chǔ)存一個(gè)月。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，可以移除培養(yǎng)基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞。

2、直接法提取RNA

（1）加入1ml Trizol試劑，混勻，冰上孵育10min。

（2）4℃，12000rpm離心10min，小心轉(zhuǎn)移上清液到不含顆粒的新EP管中。

（3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育5min。

（4）4℃，12000rpm離心15min。混合液分三層，包括最下面的苯酚 - 氯仿有機(jī)相，中間相和上層水相。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相，可留下少量上層液體?。?/span>Note：質(zhì)量比數(shù)量更重要?。?/span>

（5）加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min。

（6）4℃，12000rpm離心10min。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。

（7）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫下風(fēng)干5-10min（不要太干，過度干燥會(huì)導(dǎo)致RNA難溶解?。?。將RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。

（8）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長(zhǎng)期保存。

熒光定量PCR第二步：反轉(zhuǎn)錄

1、RNA純度和完整度鑒定

紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度和純度：在pH8.0的TE緩沖液中稀釋RNA，并在260nm和280nm下測(cè)量吸光度，一般Abs 260nm：280nm比率應(yīng)該是1.7-2.1，說明RNA的純度較好。

RNA條帶完整度測(cè)定：評(píng)估RNA的完整性，取部分樣本做瓊脂糖凝膠電泳。完整的RNA條帶包括28S，18S和5S核糖體RNA。通常，28S / 18S> 2意味著RNA具有較高的完整度。

2、反轉(zhuǎn)錄：PCR條件：42℃孵育40min，85℃加熱5min，4℃保存。將第一鏈cDNA儲(chǔ)存在-20℃。

熒光定量PCR第三步：引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)

（1）PCR擴(kuò)增子長(zhǎng)度：50-180bp；

（2）引物長(zhǎng)度17-25bp；

（3）GC含量：45-55％；

（4）Tm：58?68℃，引物對(duì)間差異不大于2℃；

（5）堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻。3′端要避開AT，GC rich的區(qū)域，避開T/C或A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個(gè)）。引物自身和引物間不能存在互補(bǔ)。引物3’末端為G或C；

（6）避免DNA污染，跨外顯子接頭區(qū)；

（7）至少設(shè)計(jì)2-3對(duì)引物，預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選最佳引物；

（8）將所有設(shè)計(jì)的引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)以確定它們對(duì)靶基因特異性。

熒光定量PCR第四步：Q-PCR反應(yīng)

注意：一般使用cDNA模板的10倍稀釋液加入反應(yīng)體系，因?yàn)檫^高濃度的反轉(zhuǎn)錄體系殘留如逆轉(zhuǎn)錄酶和相關(guān)緩沖液組分會(huì)抑制DNA聚合酶活性，從而降低擴(kuò)增效率。

1、擴(kuò)增循環(huán)。

2、溶解程序：擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，降溫至60℃，然后加熱升溫至95℃變性DNA產(chǎn)物。

變性：高溫孵育將dsDNA變成成單鏈，并松弛ssDNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通常DNA聚合酶可承受的最高溫度為95℃。如果模板GC含量高，可適當(dāng)延長(zhǎng)變性時(shí)間。

退火：退火期間，互補(bǔ)序列結(jié)合，一般使用低于引物的Tm 5℃作最適退火溫度。

延伸：70-72℃，DNA聚合酶活性最佳，并且以每秒100個(gè)堿基的速率延伸。當(dāng)qPCR中的產(chǎn)物長(zhǎng)度較小時(shí)，此步驟可與退火在60℃同步進(jìn)行。

最后進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，那實(shí)驗(yàn)步驟我們就講解到這里啦，下期咱們講講，最后一步的數(shù)據(jù)分析應(yīng)該如何分析，如何看熒光定量PCR的結(jié)果，如多您也想學(xué)習(xí)更多關(guān)于熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)和結(jié)果分析或有熒光定量PCR代做外包的需求歡迎給普拉特澤留言，技術(shù)會(huì)第一時(shí)間聯(lián)系到您的哦~

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