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細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)原理與詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟——彗星實(shí)驗(yàn)外包

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細(xì)胞的彗星實(shí)驗(yàn)背景：

分子水平的DNA 損傷檢測方法之一。除此之外，還有wb和QPCR檢測。3個(gè)檢測手段各自依據(jù)原理不同。

WB在于檢測目標(biāo)蛋白的存在來驗(yàn)證DNA 的損傷；QPCR則通過檢測DNA損傷特異基因的表達(dá)來說明DNA損傷情況，而彗星實(shí)驗(yàn)是基于單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，鑒于已損傷DNA相對完整DNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有明顯的拖帶現(xiàn)象，類似于彗星的拖尾，所以被形象的稱為彗星實(shí)驗(yàn)（單細(xì)胞凝膠電泳）。

細(xì)胞的彗星實(shí)驗(yàn)原理：

當(dāng)各種內(nèi)外源DNA損傷因子誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時(shí)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其它成分均擴(kuò)散到細(xì)胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性條件時(shí)，DNA片段可進(jìn)入凝膠發(fā)生遷移，而在堿處理和堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來，由于這些DNA的分子量很小，所以在電泳過程中會(huì)離開核DNA向陽極移動(dòng)，形成彗星狀的圖像，而未損傷的DNA部分保持球形。DNA受損越嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷片越多并且片段越小，電泳時(shí)遷移的DNA量也就越大，遷移距離越長，熒光顯微鏡下可觀察到尾長增加、尾部熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。在一定條件下，DNA遷移距離(彗星尾長)和DNA含量(熒光強(qiáng)度)分布與DNA損傷程度呈線性相關(guān)，因此，尾矩(尾部DNA的含量與尾長的乘積)成為定量測定單個(gè)細(xì)胞DNA損傷程度的主要依據(jù)。

造成DNA損傷的因素：

ROS X-射線、紫外線、抗腫瘤藥。

彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常DNA

彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果
紫外線照射后的DNA

彗星實(shí)驗(yàn)步驟：

（1）彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)z板的制備

① 第一層膠的制備：將已預(yù)熱56℃的80uL 0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖NMA（溶于無Ca2+，Mg2+的磷酸緩沖液PBS）滴到同樣預(yù)熱的載玻片的磨砂面，迅速蓋上干凈的蓋玻片，4℃放置10min使其凝固。

② 第二層膠的制備：取10μl含1000個(gè)細(xì)胞的PBS和75uL 0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖LMA（溶于無Ca2+，Mg2+的磷酸緩沖液PBS）在37℃混勻，然后輕輕揭去蓋玻片，將含細(xì)胞的LMA滴到第一層膠板上，立即蓋上干凈的蓋玻片，4℃ 放置10 min使其凝固。

③ 第三層膠的制備：最后在凝固的LMA層上滴加85 uL預(yù)熱37 ℃ 的0.5% LMA，蓋上蓋玻片，使其凝固。第一層膠的主要目的是使第二層平整和附著緊密，第三層膠的目的是對第二層細(xì)胞起保護(hù)作用。

（2）彗星實(shí)驗(yàn)待測細(xì)胞裂解，移去蓋玻片，將載玻片浸入新配置的細(xì)胞裂解液中至少裂解1h（在放第一片開始計(jì)時(shí)，再以同樣的順序取出，確保每張片子裂解時(shí)間相同）。此步驟的目的是溶解細(xì)胞膜及核膜，除去蛋白質(zhì)、RNA等，僅存留核骨架。

（3）DNA堿解旋細(xì)胞裂解后，取出載玻片，用PBS沖洗2次，以去掉載玻片表面高濃度的鹽，然后將載玻片置于水平電泳槽中，倒入新配置的堿性電泳緩沖液，約覆過膠面0.25cm。堿解旋20 min，以便使DNA在堿性條件下解螺旋形成單鏈DNA，使DNA斷鏈，在電泳場中易于遷移。

（4）單細(xì)胞電泳在25v、300mA條件下電泳20 min。

（5）中和與染色電泳完畢后，將載玻片取出，濾紙吸干電泳緩沖液，用Tris-HCl（pH7.5）中和15 min。然后每片載玻片上滴加50μl 30μg/mL的溴化乙錠（EB）溶液，避光操作，蓋上蓋玻片，避光染色20 min，即可觀察。

（6）細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果觀察與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。

彗星實(shí)驗(yàn)步驟

彗星實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟