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實驗解惑|qPCR結(jié)果與WB結(jié)果不一致？RNA表達情況與蛋白表達情況不一致？究竟是怎么回事呢?

根據(jù)生物學(xué)的中心法則，我們知道蛋白質(zhì)是由mRNA翻譯而來的。在正常情況下，我們期望基因的RNA表達水平和蛋白質(zhì)表達水平能夠保持一致，可有時天公偏不作美，在實際的研究過程中，經(jīng)常會遇到這兩者表達不一致甚至完全相反的情況，比如RNA水平降低、蛋白質(zhì)水平升高，亦或者RNA水平升高、蛋白質(zhì)水平降低。遇到這種情況，先不要慌，確保自己實驗過程沒有問題的情況下，探討這種現(xiàn)象背后的原因，并尋找可能的解決辦法，今天普拉特澤生物跟各位小伙伴一起來分析這背后的原因哦！

一、RNA表達升高，蛋白質(zhì)表達下降

轉(zhuǎn)錄后，mRNA可能經(jīng)歷剪接、加帽、加尾等加工過程，這些過程可能影響mRNA的穩(wěn)定性。如果mRNA的穩(wěn)定性下降，如由于miRNA的降解作用或其他RNA結(jié)合蛋白的負(fù)調(diào)控，就可能導(dǎo)致盡管轉(zhuǎn)錄水平升高，但mRNA的實際可用量減少，從而影響蛋白質(zhì)的合成。

一、RNA表達升高，蛋白質(zhì)表達下降

▲mRNA的翻譯速率下降

mRNA的翻譯效率也可能受到調(diào)控。例如，某些翻譯起始因子或延長因子的活性可能降低，導(dǎo)致mRNA的翻譯速率下降，即使mRNA水平升高，蛋白質(zhì)的合成量也可能不足。

翻譯后修飾的調(diào)控翻譯生成的蛋白質(zhì)可能受到翻譯后修飾的調(diào)控，如磷酸化、糖基化等，這些修飾可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性和定位。如果蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低，降解速率增加，就可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達下降。

04蛋白質(zhì)降解細(xì)胞內(nèi)可能存在特定的蛋白質(zhì)降解途徑，如泛素-蛋白酶體途徑，專門針對某些蛋白質(zhì)進行降解。如果這些途徑被激活，就可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達下降，盡管mRNA水平升高。

（在閱讀文獻的過程中看到這部分內(nèi)容一般會使用蛋白酶體抑制劑如MG132、Bortezomib等進行驗證）

05負(fù)反饋機制抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯細(xì)胞內(nèi)存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水平過高時，可能通過負(fù)反饋機制抑制相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。然而，在某些情況下，這種負(fù)反饋機制可能不夠靈敏或及時，導(dǎo)致mRNA水平已經(jīng)升高但蛋白質(zhì)表達尚未受到有效抑制。

二、RNA表達降低，蛋白質(zhì)表達升高 01mRNA的翻譯效率上升mRNA翻譯效率上升可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達升高。翻譯效率受到多種因素的影響，包括翻譯起始因子的活性、核糖體的可用性以及mRNA二級結(jié)構(gòu)對核糖體結(jié)合的影響等。

02mRNA的穩(wěn)定性上升盡管RNA表達降低，但如果這些mRNA分子在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性上升，其半衰期會延長，從而導(dǎo)致即使轉(zhuǎn)錄速率降低，mRNA的總體水平仍可能維持在一定范圍內(nèi)。這種穩(wěn)定性的上升可能由特定的RNA結(jié)合蛋白、miRNA或其他非編碼RNA介導(dǎo)。

03蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性上升蛋白質(zhì)穩(wěn)定性上升是導(dǎo)致蛋白表達升高的直接原因。這可能由蛋白質(zhì)修飾（如磷酸化、糖基化等）、蛋白質(zhì)相互作用或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的

04合成蛋白質(zhì)的速率提升某些情況下，盡管mRNA水平降低，但每個mRNA分子合成蛋白質(zhì)的速率可能提升。這可能是由于翻譯起始復(fù)合物的形成更加高效，或者核糖體在mRNA上的移動速度加快等原因

05負(fù)反饋機制不夠靈敏或及時在某些生物過程中，可能存在負(fù)反饋調(diào)控機制。例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水平過高時，可能會抑制其對應(yīng)mRNA的轉(zhuǎn)錄或加速其降解，以維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的穩(wěn)態(tài)。然而，在某些情況下
這種負(fù)反饋機制可能不夠靈敏或及時，導(dǎo)致mRNA水平已經(jīng)降低但蛋白質(zhì)表達尚未受到有效抑制。

三、RNA表達上升，蛋白質(zhì)表達不變 01mRNA很快被降解盡管mRNA表達上升，但如果這些mRNA分子的穩(wěn)定性沒有相應(yīng)上升，它們可能很快被降解，從而無法有效轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)。

mRNA的穩(wěn)定性受到多種因素的影響，比如受到RNA結(jié)合蛋白和miRNA、lncRNA等非編碼RNA的調(diào)控。

02mRNA翻譯效率未相應(yīng)提高即使mRNA水平上升，翻譯效率可能并未相應(yīng)提高。翻譯效率受到核糖體可用性、翻譯起始因子的活性、mRNA二級結(jié)構(gòu)等多種因素的影響。

如果這些因素限制了翻譯過程，即使mRNA水平增加，蛋白質(zhì)水平也可能保持不變。

03蛋白質(zhì)降解速率上升蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受到蛋白酶體等降解系統(tǒng)的影響。如果蛋白質(zhì)降解速率增加，即使mRNA翻譯生成的蛋白質(zhì)增多，也可能很快被降解掉，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平不變。

04轉(zhuǎn)錄和翻譯間的耦合被打破在正常情況下，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯是緊密耦合的過程。然而，在某些情況下，這種耦合可能被打破，導(dǎo)致mRNA水平上升而蛋白質(zhì)水平不變。
例如，翻譯起始因子的缺乏、核糖體的功能障礙等都可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄與翻譯的解偶聯(lián)。如果你總是在做實驗時總會遇上這樣那樣的問題需要幫助時，請記得在分子實驗中遇到技術(shù)問題可添加技術(shù)微信：18570028002

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本文源自公眾號：上海醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)編輯部