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一、β-乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)簡介與原理

實(shí)驗(yàn)簡介： β -半乳糖苷酶是一種是細(xì)胞溶酶體中的水解酶，能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。其結(jié)構(gòu)基因?yàn)長acZ，與LacY（半乳糖苷透性酶）和LacA（半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶）同組成乳糖操縱子，并在特異的乳糖操縱系統(tǒng)中的阻遏物、操縱基因、啟動子等的協(xié)同下，支配調(diào)節(jié)β-半乳糖苷酶的合成。β-半乳糖苷酶一般廣泛存在于動植物界中。

實(shí)驗(yàn)原理：絕大多數(shù)正常細(xì)胞被認(rèn)為僅有有限的分裂能力，在不能分裂后就進(jìn)入衰老(senescence)狀態(tài)。此時(shí)細(xì)胞仍然是存活的，但細(xì)胞的基因和蛋白的表達(dá)譜發(fā)生了很大改變。衰老的細(xì)胞不能在一些常規(guī)的刺激下再誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，并且衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期分布也比較特殊，不同于一些損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞休眠，也不同于細(xì)胞生長接觸抑制的情況。衰老細(xì)胞通常體積變大，并表達(dá)在pH6.0時(shí)有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。

二、β-乳糖苷酶染色臨床意義

在臨床上，β半乳糖苷酶，在腎近曲小管上皮細(xì)胞中含量較高。尿中β半乳糖苷酶活性可反映腎實(shí)質(zhì)，特別是腎小管的早期損傷，與尿中N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶一同測定作尿酶譜分析，有助于病程觀察和預(yù)后評價(jià)。如對各種腎病的鑒別診斷、藥物對腎的毒性作用、感染、休克、腎移植排異反應(yīng)、急性腎小管壞死等疾病的早期監(jiān)測等。衰老相關(guān)β -半乳糖苷酶染（senescenceassociatedb-galactosidase SA -β-Gal）：體外培養(yǎng)細(xì)胞在 p H 為 6 時(shí) , 其β-半乳糖苷酶染色的陽性率隨代齡增加而增加 , 這種中性β 2 半乳糖苷酶被定義為衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶 ( SA 2 β 2 gal) 。血清饑餓引發(fā)的生長抑制并不能提高 SA 2 β 2 gal 的活性 ,Werner 綜合癥患者皮膚成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)增殖能力的喪失快于正常人 ,同時(shí) ,SA 2 β 2 gal 陽性細(xì)胞的積累速度也加快。永生化細(xì)胞檢測不到 SA 2 β 2gal 的活性 , 轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)永生化細(xì)胞衰老的同時(shí) ,也誘導(dǎo)衰老相關(guān)β 2 半乳糖苷酶的活性。而且 ,老年個體皮膚組織切片衰老相關(guān)β 2 半乳糖苷酶染色的陽性率高于年輕個體。基于以上觀察 ,人們認(rèn)為這種中性β 2 半乳糖苷酶是一種很好的可用于體內(nèi)外衰老研究的生物學(xué)標(biāo)志。

三、β-乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)步驟（樣本與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌襟E均有不同）

Step1：將石蠟組織切片置于65°C恒溫箱，烤片1h左右

Step2：脫蠟。二甲苯I10min→二甲苯II10min→梯度酒精(由高到低)各5min

Step3：1xPBS洗滌3次，每次5min。注：對于冷凍切片直接按照以下步驟進(jìn)行

Step4：加入適當(dāng)體積的-半乳糖苷酶染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15min

Step5：1xPBS洗滌3次，每次5min

Step6：加入適當(dāng)量的染色工作液

Step7：37℃孵育過夜，最好把整個切片浸泡在染色工作液中。注：37℃孵育不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

Step8：1xPBS洗滌3次，每次5min

Step9：脫水:梯度酒精(由低到高)各5min→二甲苯I10min→二甲苯II10min

Step10：加上封片液封片后4℃可以保存較長時(shí)間

Step11：普通光學(xué)顯微鏡下觀察。光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到變成藍(lán)色的表達(dá)-半乳糖苷酶的細(xì)胞