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RIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享。RIP就是RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀，是研究體內(nèi) RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。普拉特澤生物分子檢測(cè)平臺(tái)為廣大科研人員提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的RIP檢測(cè)外包服務(wù)，本文就給大家分享RIP檢測(cè)技術(shù)給大家總結(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟：

一、RIP檢測(cè)原理與實(shí)驗(yàn)原理

RIP實(shí)驗(yàn)原理：RIP實(shí)驗(yàn)是研究RNA-蛋白之間的相互作用，運(yùn)用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，通過(guò)免疫學(xué)方法將RNA-蛋白復(fù)合物一起分離出來(lái)，通過(guò)對(duì)目的片段的純化與檢測(cè)（結(jié)合的RNA序列通過(guò)microarCALU-1y（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量測(cè)序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定），從而分析蛋白質(zhì)和RNA相互作用的信息。

RIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

1、儀器準(zhǔn)備：臺(tái)式冷凍離心機(jī)、渦旋振蕩器、電子天平、PCR儀、移液器、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、水平電泳槽、潔凈工作臺(tái)、-80度冰箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋

2、試劑準(zhǔn)備：無(wú)水乙醇、苯酚：氯仿：異戊醇、RIP試劑盒、1.5 mL EP管、2 × PCR MIX、IGF2BP2抗體

二、RIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作步驟

1、設(shè)計(jì)引物

2、細(xì)胞裂解

（1）加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞，室溫1000 rpm離心5 min收集細(xì)胞棄上清；重復(fù)一次。

（2）細(xì)胞沉淀中加入0.9 mL polysome lysis buffer，9 μL Protease inhibitor，4.5 μL RNase inhibitor渦旋混勻，冰上放置 10 min。

3、去除 DNA

（1）細(xì)胞裂解液中加4.5 μL DNase salt stock、10 μL DNase (20 U)，37℃溫育10 min。

（2）轉(zhuǎn)移樣品到冰浴環(huán)境，快速加入4.5 μL 0.5 M EDTA、1.8 μL 0.5 M EGTA、9 μL DTT，混勻。

（3）4℃，16,000 g 離心10 min轉(zhuǎn)移上清至新的無(wú)RNase離心管中。

4、平衡 protein A/G

（1）每組RIP樣品準(zhǔn)備20 μL protein A/G beads，加入0.5 mL polysome lysis buffer，顛倒混勻，磁力架上去上清；重復(fù)洗一次。

（2）加入20 μL polysome lysis buffer 恢復(fù)初始體積。

5、免疫沉淀

（1）將細(xì)胞裂解樣品按照0.8 mL（IP）、0.1 mL（Input）分成兩份，Input樣品-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

（2）IP 樣品加入實(shí)驗(yàn)抗體或者IgG（陰性對(duì)照），垂直混勻器 4℃孵育16 h（過(guò)夜）。

（3）IP 樣品加入準(zhǔn)備好的20 μL protein A/G beads，垂直混勻器 4℃孵育1小時(shí)，磁力架收集磁珠并去上清。

（4）IP 樣品加入0.5 mL polysome washing buffer 1、 5 μL DTT洗滌三次去上清，每次4℃孵育5分鐘。

（5）IP 樣品中加入94.5 μL polysome washing buffer 1、 0.5 μL DNase salt stock、5 μL DNase (5 U)，37℃溫育10 min后去上清。

（6）IP 樣品加入0.5 mL polysome washing buffer 2、5 μL DTT洗滌兩次去上清，每次4℃孵育5分鐘。

（7）IP樣品加入100 μL polysome elution buffer、1 μL DTT及2 μL proteinase K重懸珠子，Input樣品加入1 μL DTT及2 μL proteinase K。

（8）55℃孵育1 h，洗脫RNA，磁力架收集磁珠轉(zhuǎn)移上清至新的無(wú)RNA酶離心管中。

6、提取 RNA

（1）上清加入等洗脫體積(100 μL)苯酚-氯仿-異戊醇混合液到IP和Input樣品，顛倒混勻15秒。

（2）13000 g，4℃離心10分鐘，收集上層水相，轉(zhuǎn)移到新無(wú)RNA離心管中。

（3）加入1 μL Glycogen，10 μL sodium acetate及250 μL 100% ethanol充分顛倒混勻。

（4） –20℃靜置3 h到過(guò)夜沉淀RNA樣品。

（5） 4℃，16000 g 離心30分鐘，棄上清。

（6）加入1 mL預(yù)冷的80%乙醇，4℃，16100 g 離心10分鐘，棄上清，室溫風(fēng)干10分鐘。

（7）加入30 μL RNase-free water溶解RNA，-80℃保存。

7、RNA檢測(cè)

（1）取2 μL RNA樣品檢測(cè)RNA濃度。

7.8 結(jié)合RNA效率驗(yàn)證（PCR)

（1）參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄RNA樣品。

（2）參考PCR試劑盒配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，取10 μL PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳。

RIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟就講完啦，如果您還有什么實(shí)驗(yàn)技術(shù)問(wèn)題或有RIP檢測(cè)外包的需求歡迎隨時(shí)聯(lián)系普拉特澤生物~

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