慢病毒（Lentivirus）是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，它可以感染分裂細胞和非分裂細胞，可有效地感染包括幾乎所有的哺乳動物細胞、干細胞和原代細胞。此外，慢病毒具有嗜核性，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而可以在體內(nèi)較長期表達。慢病毒的多種優(yōu)點，使它成為基因傳遞的強大而有效的工具，獲得了廣泛的應(yīng)用。因此，慢病毒成為了實驗室的一大?？汀Ｔ谑褂寐《镜倪^程中，我們會遇到一些問題，比如細胞轉(zhuǎn)染效率低，細胞狀態(tài)差等等。為了在實驗過程中更好地使用慢病毒，我們應(yīng)該注意哪些問題呢？

慢病毒載體是經(jīng)過處理的HIV，理論上對人體是無害的，但病毒仍然具有潛在的生物學危險，慢病毒相關(guān)實驗需要在生物安全柜（BL-2級別）內(nèi)進行操作。因此在進行操作的時候，我們要按照如下基礎(chǔ)規(guī)范進行實驗：

1、在進入實驗室工作時，穿著實驗服或隔離服，戴上手套和口罩；

2、操作病毒時請盡量使用生物安全柜，小心不要產(chǎn)生氣霧或液體飛濺；

3、如果使用普通超凈工作臺操作病毒，請在打開含有病毒的容器蓋子前關(guān)閉超凈臺的風機（由于超凈臺風向外排，有可能將病毒吹向操作者），并盡快操作；盡量縮短開蓋后的病毒在關(guān)閉了排風機的超凈臺中停留的時間，封閉所有含有病毒的容器、耗材、廢液后，再打開超凈臺風機；

4、如果操作時臺面有病毒污染，請立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡過夜后棄去；

5、如需離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后離心；

6、實驗結(jié)束，脫掉手套前先消毒再摘除手套，隨后用肥皂洗手。

一、慢病毒的儲存與稀釋

1、病毒長期儲存于-80℃冰箱，-20℃保存不要超過1周，4℃保存不要超過3天；

2、病毒的運輸采用干冰，收到病毒液后若幾天內(nèi)用于實驗，可于4℃保存（于3天內(nèi)用完）。若短時間內(nèi)不用，收到病毒后應(yīng)立即放入-80℃冰箱進行長期保存。病毒使用過程中要避免反復凍融，否則會降低病毒滴度；

3、一般病毒可在-80℃存放1年，但存放時間超過6個月后使用，需重新檢測病毒滴度；

4、需要稀釋病毒時，將病毒從-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解，然后用PBS或培養(yǎng)基（不含血清）稀釋到所需濃度后輕柔混勻，盡快使用；

二、慢病毒的使用

預(yù)實驗摸索慢病毒的最佳MOI

每種細胞對慢病毒的敏感性不同，有些容易感染，有些不容易感染，不同慢病毒的熒光強度也有差異，所以進行慢病毒操作實驗之前，首先要了解MOI的概念，MOI（Multiplicity of Infection，感染復數(shù)）是指病毒感染細胞的比例。

選擇合適的MOI值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表達量越高，相對細胞的毒性越小。對于分裂活躍的細胞，比如293細胞MOI=1時，95%以上的細胞均可以表達目的基因。而對于非分裂細胞，比如原代細胞，感染效率較低，MOI值可能達到200-300。我們建議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等）感染細胞MOI值的摸索。

1、感染前一天，一般用24孔板接種2×10?個細胞，第二天病毒感染時的細胞匯合度達到40-50%左右；

2、MOI值的設(shè)置若有文獻參考，可以參考值為中心設(shè)置梯度覆蓋參考值，舉例：文獻中某細胞系慢病毒MOI值為10，則設(shè)置MOI梯度為2.5,5,10,20,40等；若無文獻參考可按10倍梯度稀釋進行設(shè)置，每個梯度3次重復；

注：（1）每孔加病毒量（μL）=MOI*細胞數(shù)/滴度（TU/mL）*103

一般第二天按照細胞數(shù)倍增計算;如果病毒滴度很高，每孔加病毒量過少，可進行稀釋后再加；Polybrene（常用濃度為5-10μg/mL）是否添加根據(jù)細胞種類及具體實驗決定；

3、第三天（加病毒后12h-24h左右），棄去含病毒就培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

4、第五天，觀察熒光情況，并進行拍照，確定最適合MOI值；

5、對于生長緩慢代謝慢的細胞，可以適當延長病毒感染時間，根據(jù)細胞狀態(tài)決定何時更換培養(yǎng)基，保持細胞的活性。

慢病毒感染目的細胞

1、通過感染預(yù)實驗，確定細胞接種密度、最佳MOI等條件。正式實驗前，調(diào)整并保持良好的細胞狀態(tài)；

2、按實驗需要將細胞鋪板（qPCR檢測用12孔板，WB檢測用6孔板或更大面積的培養(yǎng)皿），細胞數(shù)以第2天密度約40-50%為宜，37℃ 培養(yǎng)過夜；

3、感染前，從-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化，用PBS稀釋成所需濃度，用移液器吹打均勻；

4、感染前給細胞換液，然后向每孔中均勻滴加稀釋好的病毒液，輕輕搖勻，37℃培養(yǎng)過夜；

5、感染后根據(jù)細胞狀態(tài)決定，更換新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)。若病毒對細胞無毒性也可不換液。感染后48-72h觀測熒光，拍照記錄；

6、根據(jù)需要，或收細胞抽提RNA檢測目的基因在mRNA水平的表達，或收細胞抽提蛋白檢測目的蛋白的表達，或收細胞進行細胞功能檢測；

7、在培養(yǎng)過程中，需要篩選穩(wěn)定攜帶 Puromycin 抗性基因的病毒，則需換上含適當濃度 Puromycin 的新鮮完全培養(yǎng)液。

三、慢病毒在使用過程中可能遇到的其他問題

如何使用慢病毒感染細胞？

使用慢病毒感染細胞的操作流程取決于細胞種類，因此首先要了解細胞的來源和背景。