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目前，由PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變相比于其他突變技術(shù)具有周期短、成功率高、不受酶切位點(diǎn)限制等優(yōu)點(diǎn)，是使用最普遍的定點(diǎn)突變方法。

DNA分子中由于發(fā)生堿基對(duì)的增添、缺失或改變進(jìn)而引起基因結(jié)構(gòu)的改變，稱為基因突變。

定點(diǎn)突變（mutagenesis）是通過(guò)PCR等方法向目的DNA片段中引入突變，包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。該技術(shù)能迅速、高效地改變DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是研究人員在實(shí)驗(yàn)室中改造、優(yōu)化基因常用的一種非常有用的手段。

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定點(diǎn)突變這么常見(jiàn)的技術(shù)，實(shí)驗(yàn)如何進(jìn)行呢？

一步法（直接以質(zhì)粒為模板）。為了更好的擴(kuò)增效率，可以將正因和反向引物分開(kāi)擴(kuò)增，避免二聚體的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)流程如下（轉(zhuǎn)載自科學(xué)網(wǎng)mzxg的博客）：

1、引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)一對(duì)正向和方向引物。建議引物長(zhǎng)度為30-40bp。

基本的引物設(shè)計(jì)原則就不贅述了，這里要加上一條突變引物的設(shè)計(jì)原則。

一般是以突變的堿基為中心，兩邊加上12-20 bp序列，若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，引物至少要11-12個(gè)base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少12個(gè)base pair，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。

2、各20ul體系

18ul 混合物+2uL primer F

18ul 混合物+2uL primer R

在兩個(gè)tube中配好反應(yīng)體系后，置于PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?/span>

98℃ 1 min

98℃ 10sec

60℃(可調(diào)整) 20sec

72℃ 根據(jù)質(zhì)粒大小調(diào)整

steps 2-4 for 12 cycles

72℃ 5 min

4℃保存

3、反應(yīng)完成后，將兩個(gè)反應(yīng)體系混合后成40ul體系，并且補(bǔ)加適量的高保真聚合酶（如Q5），然后使用以上反應(yīng)程序繼續(xù)反應(yīng)16 cycles。

4、得到的PCR產(chǎn)物加入1ul DpnI 酶和4ul的10*NEB cutsmart buffer消化模板質(zhì)粒（原理是DpnI 酶只消化甲基化的DNA）置于37度反應(yīng)1h（或者2-3h，保證處理干凈）。

5、取5ul 跑膠看是否有條帶，剩余的取部分做細(xì)菌轉(zhuǎn)化，涂板。

6、12h 后挑取3-5個(gè)克隆送測(cè)序。

除了一步法，還有很多其他方法可以選擇，比如搭橋法/重疊延伸PCR，是通過(guò)三次PCR實(shí)現(xiàn)的。

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重疊PCR法原理圖

每個(gè)突變點(diǎn)需要合成一對(duì)相互Overlap（重疊）20－25bp的突變引物，你的試驗(yàn)中需合成4對(duì)（4個(gè)點(diǎn)）突變引物。另外兩側(cè)需要合成一對(duì)引物，以便擴(kuò)增全長(zhǎng)序列（稱為全長(zhǎng)引物）。

舉一突變點(diǎn)為例，如需突變A點(diǎn)。先作兩個(gè)PCR：1使用正向全長(zhǎng)引物和A突變點(diǎn)的反向突變引物；2突變點(diǎn)A的正向突變引物和全長(zhǎng)反向引物。而后回收兩段PCR產(chǎn)物，取少量產(chǎn)物在PCR體系中先自延伸十周，而后加入正向和反向全長(zhǎng)引物擴(kuò)增全片斷?；厥盏诙喌?/span>PCR產(chǎn)物，酶切，接入克隆載體，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如正確則第一個(gè)位點(diǎn)突變完成。以此類推，突變剩下的位點(diǎn)。

優(yōu)點(diǎn)是：成功率高，應(yīng)用廣泛。

缺點(diǎn)是：擴(kuò)增的序列盡量不要太長(zhǎng)，否則成功率不高。需要對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行純化。

倘若質(zhì)粒模板無(wú)法正常擴(kuò)增，可能的原因有哪些？有哪些解決方法呢？點(diǎn)此跳轉(zhuǎn)