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流式檢測——細(xì)胞周期檢測常見問題解答與處理【干貨滿滿】

流式檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)的常見問題解答由普拉特澤生物根據(jù)承接的幾千例流式檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和各種實(shí)驗(yàn)過程中的技術(shù)咨詢總結(jié)而來，普拉特澤生物專注提供線下生物實(shí)驗(yàn)研究，積累了大量經(jīng)驗(yàn)，為廣大科研工作者提流式檢測細(xì)胞周期等各類生物學(xué)實(shí)驗(yàn)外包。

前兩篇呢，我們講了用流式檢測細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)原理、步驟以及操作時(shí)的注意事項(xiàng)，鏈接奉上，忘記的同學(xué)請(qǐng)自行回去復(fù)習(xí)：

流式檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

流式檢測細(xì)胞周期原理及實(shí)驗(yàn)步驟分析

這兩篇常見問題集大家咨詢的流式和細(xì)胞周期檢測問題、我們自己操作時(shí)總是遇到的問題之大成，拿好筆記本我們準(zhǔn)備開始記錄吧：

問題一：在測定細(xì)胞周期的時(shí)候,由于固定、消化等處理后會(huì)出現(xiàn)很多細(xì)胞碎片，影響測量結(jié)果，無法找到G1期細(xì)胞群怎么辦？

回答：在測定細(xì)胞周期的時(shí)候，除了設(shè)置好獲取數(shù)據(jù)的模版外，另外設(shè)置直方圖，測量模式為對(duì)數(shù)(log)，調(diào)整放大倍數(shù)，使二倍體峰出現(xiàn)在橫坐標(biāo)10*3的位置，就很容易的找到了二倍體峰和細(xì)胞周期個(gè)時(shí)相細(xì)胞的分布情況。

問題二：可不可以用70~75%乙醇直接固定細(xì)胞，反正乙醇固定細(xì)胞的終濃度也是這么多？

回答：當(dāng)然不可以，直接用70~75%乙醇加入很容易導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞，影響固定效果，甚至容易導(dǎo)致固定后無細(xì)胞沉淀的現(xiàn)象。應(yīng)該在細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞后，緩慢地滴入無水乙醇中，使其終濃度為70~75%乙醇。

流式檢測細(xì)胞周期常見問題解答與處理

問題三：細(xì)胞量太少，得不到數(shù)據(jù)結(jié)果白做了咋辦？

回答：咱就是說，待測的細(xì)胞已經(jīng)制備完了太少不容易挽救，說一說正確的操作方法吧。

1）首先，要保證收集足夠的細(xì)胞樣品，普拉特澤技術(shù)小姐姐推薦至少需要手機(jī)10的6次方左右；如果藥物處理后細(xì)胞死亡過多，應(yīng)該降低藥物濃度。

2）然后，固定細(xì)胞時(shí)先用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再逐滴滴入無水乙醇中，操作方法請(qǐng)參照上一步。

3）同時(shí)細(xì)胞清洗時(shí)，不可過度吹打細(xì)胞，以防產(chǎn)生過多的細(xì)胞碎片。

4）最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機(jī)，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點(diǎn)，不要吸完。

問題四：做流式分析細(xì)胞周期時(shí)，收集了10^6左右的細(xì)胞，但是固定后沒有細(xì)胞沉淀，甚至PBS洗滌后上機(jī)已經(jīng)沒有細(xì)胞了，哪個(gè)環(huán)節(jié)出了問題？

回答：確定收集了足量細(xì)胞但是沒有細(xì)胞沉淀且上機(jī)沒看見待測細(xì)胞的話，應(yīng)該洗滌過程中細(xì)胞丟失了。應(yīng)該：

1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機(jī)。

2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒，吸上清時(shí)最好殘留1 mm左右的水膜，不要吸完。

3）離心的轉(zhuǎn)速或時(shí)間可以適當(dāng)增加。

4）每次加試劑時(shí)，吸頭最好不要接觸液面，混勻時(shí)最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細(xì)胞。

問題五：什么樣的結(jié)果是正常的？

回答：請(qǐng)大家抱著結(jié)果自己對(duì)號(hào)入座~

1）G2/M期細(xì)胞的DNA含量是G1期的2倍，在直方圖上形成一個(gè)2倍于G1信號(hào)峰的高斯峰。

2）CV(變異系數(shù))表示峰的寬度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被認(rèn)可。

3）RCS最好是在1~3，高于5則不被認(rèn)可。RCS高，說明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預(yù)期值的差別比較大，可能由于處理細(xì)胞的時(shí)候RNA酶消化不好，或者是PI的濃度不佳造成的。

問題六：怎樣提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分辨率和精確度？

回答：變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV值）反映G0/G1峰分辨率和精確度。而樣品CV值為樣品固有，與樣本制備過程中細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)。細(xì)胞碎片越少、細(xì)胞聚團(tuán)越少、RNA酶消化越充分，可以減少樣本的CV值，提高G0/G1峰分辨率和精確度。
好啦，流式檢測細(xì)胞周期操作過程中我們比較常見的問題就給大家回答到這里,歡迎大家踴躍留言，湊齊八個(gè)我們召喚神龍！
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