流式檢測細胞周期原理及實驗步驟分析——科研小白
2022-03-09 14:29:36
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
大家好，今天我們來講一講用流式檢測細胞周期的實驗原理和詳細步驟，本文是普拉特澤生物根據(jù)承接的幾千例流式檢測外包實驗與同學們的技術(shù)咨詢分析，發(fā)現(xiàn)相當一部分來外包實驗和技術(shù)咨詢的問題都是流式檢測相關的實驗，特別是流式檢測細胞周期，既然這個實驗折磨了大家這么久，那這一篇，我們就來好好地給科研小白們盤一盤吧！
一、流式檢測細胞周期實驗原理
流式利用不同熒光物質(zhì)標記的單克隆抗體，與待測成分作用，然后上流式細胞儀檢測待測細胞。待測細胞隨流動室內(nèi)的流動鞘液排列成單列，一個個迅速通過激光聚焦區(qū)，激光在對每個細胞進行照射時可同時得到前向角散射和側(cè)向角散射2種散射光以及激發(fā)熒光標記物發(fā)出的信號，利用這些信號，可計算出相對含量，從而得到細胞群的相對比值。
細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。某些細胞在分裂結(jié)束后暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，執(zhí)行一定生物學功能（G0期）。由于細胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量（2N），而G2/ M期具有四倍體細胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量。因此，通過流式細胞儀PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期。
二、流式檢測細胞周期實驗詳細步驟
1、培養(yǎng)細胞周期待測細胞：在合適的溫度、營養(yǎng)、酸堿度條件下通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞，可以借此研究細胞周期、細胞的信號轉(zhuǎn)導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等實驗。細胞培養(yǎng)時間：一般藥物等處理時間最好是大于細胞增殖一代的周期，可根據(jù)具體細胞分裂時間決定，如乳腺癌細胞我們一般處理24小時。這里就不展開講啦，感興趣的同學可以看看另一篇文章：原代細胞培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)該用什么方法？
2、收集檢測細胞周期的細胞：收集細胞取適量的對數(shù)生長期細胞接種于6厘米中，在相應的條件下(如藥物)處理相應時間后，倒去培養(yǎng)基，用胰酶適度消化細胞，離心收集細胞，棄去上清。細胞數(shù)量:一般情況下，由于在細胞周期中分析的細胞數(shù)應達到1.0*104~3.0*104才具有統(tǒng)計學意義。因此，單次流式細胞儀檢測細胞周期時，1份樣品的細胞數(shù)量至少為106。
3、清洗及固定檢測細胞周期的細胞：用PBS清洗細胞2遍，吸凈離心管殘余的PBS后，加入300微升PBS重懸，將細胞吹散，避免細胞成團，隨后將細胞懸液逐滴滴入700uL無水乙醇(預冷)，即用70-75%的乙醇固定細胞，然后4℃固定過夜。由于流式分析時需要的是單個細胞懸液，因此在操作過程中需充分混懸細胞，細胞固定后，不可過度吹打細胞，以防產(chǎn)生過多的細胞碎片。
4、再次洗滌檢測細胞周期的細胞：第二天，離心收集細胞，用移液槍吸走上清，然后用1mLPBS重懸細胞并離心清洗2~3遍。細胞可以長期保管在-20℃，可存放1個月，染色不會受影響;用PBS重懸細胞時，動作要輕柔。此外，離心速度(1200rpm/min)不要過快以免造成細胞的破裂。
5、避光孵育待測細胞：RNA酶消化和PI染色在避光條件下，每個樣品加入1避光RNase(10mg/mL)和5 mg/m(5mg/mL)混勻后室溫避光條件下孵育30min
6、上流式細胞儀檢測：將檢測樣品轉(zhuǎn)移到5mL的流式管后用流式細胞儀檢測細胞周期，采用flowjo或 modifit軟件進行DNA含量分析，上機檢測時，必須重懸成細胞懸液后再檢測，否則容易堵儀器管道；如果細胞過多或聚團嚴重，可先用300尼龍網(wǎng)過濾，然后再上機檢測。
那么以上就是用流式檢測細胞周期的原理和詳細實驗步驟啦，關于流式的結(jié)果分析怎么看，請點擊：流式結(jié)果怎么看【干貨分享】
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