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酵母雙雜交常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法上【酵母雙雜外包】

大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是酵母雙雜實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法上篇，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)作為普拉特澤生物分子檢測(cè)平臺(tái)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，在上百例酵母雙雜實(shí)驗(yàn)外包中，積累了大量的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)過(guò)程有時(shí)遇到非常多的問(wèn)題，本文就把這些實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)問(wèn)題解決方法分享給大家！

問(wèn)題一：滅菌后酵母培養(yǎng)基顏色變成棕褐色怎么辦？

SD系列的培養(yǎng)基預(yù)混了葡萄糖，在滅菌過(guò)程中由于滅菌時(shí)間較長(zhǎng)，或者滅菌后在高溫條件下長(zhǎng)時(shí)間放置，引起培養(yǎng)基中葡萄糖碳化，導(dǎo)致顏色變深。通常情況下，對(duì)酵母培養(yǎng)不會(huì)產(chǎn)生較大影響（對(duì)個(gè)別畢赤酵母菌種影響較大），可以通過(guò)控制滅菌時(shí)間和滅菌溫度來(lái)減少碳化程度，如118℃滅菌15分鐘，并及時(shí)倒板。另外Coolaber產(chǎn)品中SC系列酵母培養(yǎng)基，不包含葡萄糖，需要將過(guò)濾除菌的葡萄糖加入滅菌后的酵母培養(yǎng)基中，這種方法配制的培養(yǎng)基，呈現(xiàn)透明偏白色。

問(wèn)題二：酵母培養(yǎng)基不凝膠，或者凝膠硬度不夠怎么辦？

調(diào)整酵母篩選培養(yǎng)基的pH（5.8）; 適當(dāng)增加瓊脂（建議量20g/L）。2019年后Coolaber公司出品的酵母培養(yǎng)基，只需要加入適量的去離子水，無(wú)需調(diào)pH，直接滅菌即可。

問(wèn)題三：培養(yǎng)過(guò)程中酵母細(xì)胞變成粉色的可能原因。

培養(yǎng)基中腺嘌呤（Ade）濃度低；或酵母細(xì)胞代謝途徑產(chǎn)生問(wèn)題。一般通過(guò)往培養(yǎng)基中補(bǔ)加硫酸腺嘌呤（60mg/L）來(lái)改善這一情況。Coolaber所有酵母培養(yǎng)基均加入足夠的腺嘌呤。實(shí)際操作中，酵母變粉色也并不影響蛋白間的相互作用。

問(wèn)題四：酵母細(xì)胞生長(zhǎng)慢怎么辦？

可能原因：酵母表達(dá)的誘餌蛋白對(duì)細(xì)胞有毒害作用，影響酵母生長(zhǎng)。

解決辦法：可通過(guò)選擇低敏感性的酵母菌株；或選用低拷貝數(shù)的表達(dá)載體。

問(wèn)題五：誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞是有毒的，該怎樣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)？

在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)不好的菌株可以在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得很好。首先重懸克隆于1mL的SD/–Trp（PM2251），接著將重懸液平鋪于5 個(gè)100mm的SD/–Trp平板（PM2252），在30℃下溫浴，直至平板上的克隆相互連在一起。用5mL 0.5X YPDA（PM2011）刮下每塊板上的克隆，并收集到一管中，這樣就可以使用這個(gè)細(xì)胞重懸液進(jìn)行正常的雜交反應(yīng)。

問(wèn)題六：篩選培養(yǎng)基上克隆太多怎么辦？

可能原因：可能誘餌蛋白存在自激活，自身就可以激活下游篩選標(biāo)記的表達(dá)；或者是篩選條件過(guò)于寬松。

解決辦法：選用更為嚴(yán)格的篩選條件抑制誘餌蛋白的自激活活性，如果效果不理想，可以刪除誘餌蛋白能夠引起自激活活性的結(jié)構(gòu)域，再用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。

問(wèn)題七：篩選培養(yǎng)基上克隆太少怎么辦？

可能原因：酵母雜交效率低；或篩選條件太嚴(yán)格

解決辦法：延長(zhǎng)雜交時(shí)間，提高雜交效率；放寬篩選條件。

問(wèn)題八：酵母質(zhì)粒提取比較繁瑣，有沒(méi)有好的替代方法？

Coolaber出品的酵母陽(yáng)性克隆快速鑒定試劑盒（SK2420）僅僅需要高溫加熱酶解酵母菌3-5分鐘就可以獲取酵母質(zhì)粒粗提物，完全可以用于PCR驗(yàn)證。

問(wèn)題九：獲得的陽(yáng)性克隆，PCR檢測(cè)有多條片段。

可能原因：一個(gè)酵母細(xì)胞可以包含多個(gè)捕獲蛋白。

解決辦法：選取單克隆劃板2-3次，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，直到?jīng)]有分離，找到陽(yáng)性克隆，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

問(wèn)題十：雜交效率不高，怎么辦？

效率不高，可能是雜交細(xì)胞數(shù)量不夠，可以適當(dāng)增加誘餌蛋白的液體培養(yǎng)量，保證有足夠的細(xì)胞數(shù)量。也可以延長(zhǎng)雜交時(shí)間，直至通過(guò)顯微鏡鏡檢觀察到存在三葉草形狀的合子產(chǎn)生，再進(jìn)行后續(xù)操作。

好啦，那關(guān)于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)問(wèn)題上篇咱們就介紹到這里啦，如果沒(méi)有您遇到過(guò)的問(wèn)題可以看一看《酵母雙雜實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題下篇》，或者直接留言給客服，技術(shù)會(huì)一對(duì)一詳細(xì)技術(shù)答疑的哦。如果您有酵母雙雜實(shí)驗(yàn)外包的需求，請(qǐng)認(rèn)準(zhǔn)——普拉特澤生物！

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