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對于生信的小伙伴來說，Western Blot是最常用的蛋白定量表征手段之一。WB不僅用于判斷蛋白是否表達，更重要的是用于半定量比較不同樣品中目標蛋白的相對含量變化。通過對條帶灰度值的測量，并結(jié)合內(nèi)參蛋白進行歸一化處理，可以實現(xiàn)對蛋白表達水平的可靠比較。

本期普拉特澤生物來分享如何使用Image J對WB進行蛋白定量并用Graphpad美圖全過程。

1.打開Image J軟件，跳出彈窗，如下圖所示；

2.點擊File—Open—選擇打開目標WB蛋白條帶；

3.依次點擊Image—Type—8bit；

4.去除背景影響，點擊Process—Subtract Background，在跳轉(zhuǎn)出的對話框，在Rolling ball radius 選擇50pixels；

5.設置參數(shù)，點擊Analyze—Set Measurements—選擇參數(shù)Area、Min& max gray value、Integrated density和Mean gray value；

 6.接著點擊矩形，勾選出條帶部分；

7.點擊Analyze—Gels—Select First Lane；接著再點擊Analyze—Gels—Plot Lanes；

8.在跳出的對話框，點擊直線，按住shift鍵，依次對各個峰進行繪制封閉；

9.點擊魔法棒工具，依次點擊各個峰，會跳出的各個峰的面積，即為WB各個蛋白條帶的面積；按照上述步驟，重復平行操作3次。

10.復制值到Excel中，對所有值進行內(nèi)參歸一化。

11.打開Graphpad軟件，選擇Column，點擊create；

12.將數(shù)據(jù)導入到軟件中，點擊Analyze—選擇One-way ANOVA，點擊ok；

13.點擊繪圖，選擇Individual values，選擇帶數(shù)據(jù)點的柱形圖；

14.接著對圖形進行美化，其中包括顏色、圖形邊框、字體、坐標軸等，其最終效果圖如下圖所示：

ImageJ的WB定量，本質(zhì)是：在相同ROI下提取條帶積分灰度→扣背景→用內(nèi)參歸一化→轉(zhuǎn)換為可統(tǒng)計的表達量變化→使用繪圖軟件繪圖。大家學會了嗎？