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載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)步驟與問(wèn)題解析【附視頻教程】

載體構(gòu)建是為了把DNA分子運(yùn)送到受體細(xì)胞中去，必須尋找一種能進(jìn)入細(xì)胞、在裝載了外來(lái)的DNA片段后仍能正常復(fù)制的運(yùn)載體，載體主要有病毒和非病毒兩大類(lèi)，目前理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒。而在基因工程中，常用的載體是人工改造構(gòu)建的質(zhì)粒，載體構(gòu)建即是構(gòu)建含外源DNA的質(zhì)粒。
那么質(zhì)粒是什么？它是指存在于細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞中、獨(dú)立于染色體外、能進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。20世紀(jì)80年代質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)，最初發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒均由研究者根據(jù)表型、大小等特征自行命名，如F因子（fertility factor，致育因子）、R質(zhì)粒（resistance factor，抗性質(zhì)粒）和Col質(zhì)粒（colicin，大腸桿菌毒素質(zhì)粒）等。

質(zhì)粒.png

一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素是什么呢？

1、復(fù)制起始位點(diǎn)Ori，即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)；

2、抗生素抗性基因；

3、多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)；

4、P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子；

不同啟動(dòng)子.png

5、Terms 終止信號(hào)；

6、poly（A）加尾信號(hào)。

不同載體的實(shí)驗(yàn)步驟（總括）

關(guān)于過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建與干擾載體構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)下圖，
詳細(xì)的片段獲取與連接方式點(diǎn)此跳轉(zhuǎn)

當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)無(wú)克隆的現(xiàn)象

可能的原因主要是連接不成功或者連接成功，但轉(zhuǎn)化失敗。具體原因分別如下：

可能原因一：引物設(shè)計(jì)不合理；

解決辦法： 1、設(shè)計(jì)原則：同源臂（15-25bp，GC含量40%-60%）+酶切位點(diǎn)（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求保留或刪除）+基因特異性引物；

可能原因二：載體與目的片段重組比例不當(dāng)；

解決方法： 1、載體和目的片段濃度測(cè)定方法：常用吸光度或瓊脂糖電泳法；

2、載體與目的片段添加比例： ①單片段建議：最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3；

②多片段建議：最適DNA使用量為每片段（含線性化載體）0.03pmol；

可能原因三：載體與目的片段不純；

解決方法： 1、推薦對(duì)線性載體、PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化；

2、純化產(chǎn)物建議溶解在pH8.0的ddH2O中保存；

3、若為未純化的DNA，加入總體積不超過(guò)反應(yīng)體系體積的1/5；

可能原因四：試劑盒失效或者操作問(wèn)題；

解決方法：建議做試劑盒附帶的陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，判斷方法：

1、若陽(yáng)性有克隆并檢測(cè)為陽(yáng)性，則排除試劑盒問(wèn)題；

2、若陽(yáng)性對(duì)照無(wú)克隆，可能是操作問(wèn)題或試劑盒失效。

載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn) 視頻教程地址（建議微信打開(kāi)）：http://weike.fm/RuJi1a25c

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