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  DNA染色法檢測支原體步驟由普拉特澤生物為大家總結分享，DNA染色法是常見的支原體檢測方法中最簡單、最經濟的方法。普拉特澤生物表達檢測平臺長期為基礎科研人員提供支原體檢測外包服務，保證結果真實。

  DNA染色法較為快捷，方法簡單，但其靈敏度有一定的欠缺，易造成漏檢。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿，其激發(fā)波長為350nm（紫外激發(fā)），發(fā)射波長為420nm。該染料會結合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域，由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(55%~80%），所以可被染色而檢測到。支原體污染的細胞經染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點，即為支原體DNA, 證明該細胞有支原體污染。我們來一步步看：

  一、實驗準備

        1、CO2 培養(yǎng)箱、無菌小爬片。無菌培養(yǎng)皿、不含抗生素的完全培養(yǎng)液

        2、二苯甲酰胺熒光染料濃縮液(50μg/ml) 。稱取5mg 二苯甲酰胺熒光染料加入100 ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液中，在室溫下用磁力攪拌30~40 min, 使完全溶解，-20℃ 避光保存。

        3、二苯甲酰胺熒光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1 ml 上述濃縮液，加至100ml 無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 溶液中，終濃度為0.5μg/ml 。

        4、固定液，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液為細胞固定液。

        5、封片液。0.1mol/L枸櫞酸22.2ml，0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml，以上三者混勻，調pH 至5.5 。

        6、不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks平衡鹽溶液或PBS。經多種方法檢測確定為支原體陰性的VERO 細胞。

        二、DNA染色法檢測支原體操作步驟

        1. 無菌收集待測細胞上清：懸浮細胞離心后取上清液。

        2. VERO 細胞爬片：將小爬片無菌置于小培養(yǎng)皿內，滴加VERO 細胞懸液(細胞濃度約3×104 個/ml) 2~3ml, 置于CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h 使其貼壁。

        3. 制備標本。向6 孔板內滴加待檢細胞上清液約1ml, 注意設立對照組（已證實的支原體陽性和陰性細胞上清液），培養(yǎng)48h 后( VERO 細胞匯合前）將細胞爬片從平皿中取出。

        4. 漂洗—將細胞爬片置于培養(yǎng)皿中，用不含酚紅、NaHCO3 的Hanks 溶液（或PBS） 漂洗3次。

        5. 固定—用乙酸：甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。

        6. 漂洗—待固定液自然風干后用去離子水漂洗3 次。

        7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。

        8. 漂洗—去離子水中漂洗3 次，每次1 ~2 min 。

        9. 封片，紫外激發(fā)，觀察。

        三、實驗結果判斷

        當陰性及陽性對照結果均成立時，結果有效。

        1. 陰性結果僅見待檢細胞的細胞核呈現(xiàn)藍色熒光。

        2. 陽性結果熒光顯微鏡下細胞周圍或細胞膜表面可見大小不等、不規(guī)則的藍色熒光小點和絲狀點。

        四、DNA染色法檢測支原體注意事項

        1. 嚴格配制工作液及封片液。

        2. 保證作為指示細胞的VERO 細胞沒有被支原體污染。

        3. 必須同時設立陽性及陰性對照，注意重復，以排除假陽性和假陰性結果。
  4. 應全面觀察爬片，并注意可疑陽性的熒光點是凋亡小體還是支原體污染。

        5. 可適當調整熒光染料的工作濃度和染色時間，避免出現(xiàn)非特異性染色，如胞漿著色。

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