SQSTM1/p62這個很熟悉吧？

做自噬研究的小朋友應(yīng)該都對它十分了解了。

不熟悉的小朋友請往下看：

SQSTM1/p62作為信號樞紐和選擇性自噬受體，參與包涵體的形成和自噬過程。

自噬途徑的許多關(guān)鍵成分都經(jīng)歷了泛素化修飾，而這種修飾已被證明在自噬調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

SQSTM1的泛素化也會發(fā)生，并且在泛素脅迫下顯著升高。泛素化已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)SQSTM1的活性。

前期研究發(fā)現(xiàn)了幾種重要的泛素連接酶，根據(jù)它們的泛素化位點(diǎn)，抑制或促進(jìn)SQSTM1的功能，我已經(jīng)幫大家整理好了：

TRIM21

E3泛素連接酶TRIM21：直接與PB1結(jié)構(gòu)域內(nèi)的lysine 7 (K7)位點(diǎn)SQSTM1相互作用并泛素化。這種泛素化作用顯著削弱SQSTM1的寡聚化，進(jìn)而抑制了其隔離功能。

RNF166

E3連接酶RNF166：催化K29，K33，K91，和K189位點(diǎn)上的多聚泛素化。RNF166介導(dǎo)的泛素連接酶活性促進(jìn)SQSTM1在細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的外食性降解中的作用。

NEDD4

E3泛素連接酶NEDD4：與SQSTM1相互作用并泛素化以實(shí)現(xiàn)包涵體自噬。

Cullin 3

KEAP1-CUL3 (cullin 3)：在其UBA結(jié)構(gòu)域的K420處泛素化SQSTM1，以增強(qiáng)SQSTM1的隔離活性和自噬降解。K420的泛素化可能會破壞二聚化，從而釋放SQSTM1識別多泛素化載體的能力以進(jìn)行選擇性自噬。泛素脅迫誘導(dǎo)K420的泛素化，從而提高大體積和選擇性自噬的通量。

以上都是泛素化酶對SQSTM1的作用。但目前，SQSTM1特異性的去泛素化酶還未被鑒定出來。

那么，本文的主角

就要出場啦！

看表情包干嘛？一起愣著，別學(xué)習(xí)??！

本文高光：

1. USP8(泛素特異性肽酶8)直接與SQSTM1相互作用并去泛素化。優(yōu)先去除SQSTM1中賴氨酸11 (K11)連接的泛素鏈。

2. USP8主要在其UBA域內(nèi)K420位點(diǎn)去泛素化SQSTM1。

3. USP8抑制了SQSTM1野生型細(xì)胞的自噬流，但抑制了其突變體K420的自噬流。

結(jié)論：

USP8通過在K420位點(diǎn)去泛素化SQSTM1，成為自噬的負(fù)調(diào)控因子。

速度看fig（s）~

Fig1：USP8與自噬受體SQSTM1相互作用：

為何選擇USP8與SQSTM1作為研究對象？

SQSTM1被鑒定為非典型蛋白激酶C亞型的支架蛋白，定位于溶酶體靶向的內(nèi)吞體。推測內(nèi)含體相關(guān)的去泛素化酶可能調(diào)節(jié)SQSTM1的泛素化。USP8/UBPY同樣位于內(nèi)吞體，可調(diào)節(jié)包括表皮生長因子(EGF)受體在內(nèi)的許多蛋白質(zhì)的內(nèi)體分選。因此推測USP8可能與SQSTM1相互作用并調(diào)節(jié)其泛素化。

作者通過co-ip、GST pulldown、截斷式co-IP、免疫熒光共定位等方式，結(jié)果都指向USP8與自噬受體SQSTM1有結(jié)合關(guān)系。

Fig2：USP8在體外和體內(nèi)均能去泛素化SQSTM1：

考慮到USP8是一種去泛素化酶，接下來作者確定USP8是否在體內(nèi)和體外都可以作為去泛素酶作用于SQSTM1的去泛素化。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都驗(yàn)證了USP8顯著降低了SQSTM1泛素化的水平（圖2a、b）。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察到USP8能夠減少蛋白酶體抑制和熱休克等應(yīng)激條件下脅迫條件誘導(dǎo)的SQSTM1的泛素化(圖2D)。泛素化的SQSTM1，連同泛素化的載體，不斷被招募到生長中的自噬體中進(jìn)行溶酶體降解。在基礎(chǔ)條件下，細(xì)胞中幾乎沒有被泛素化的SQSTM1。在BafA1（一種通過阻斷自噬體/溶酶體融合來抑制自噬的抑制劑）處理的MEF中敲除內(nèi)源性USP8，顯著增強(qiáng)了內(nèi)源性SQSTM1的泛素化種類(圖2E)。這些結(jié)果表明USP8是一個SQSTM1去泛素酶。

Fig3：USP8優(yōu)先從SQSTM1中去除k11連接的泛素鏈：

冷知識：泛素蛋白本身攜帶7個賴氨酸殘基，已經(jīng)鏈接到底物蛋白上的泛素分子的賴氨酸殘基可以繼續(xù)發(fā)生泛素化修飾，形成泛素鏈。據(jù)報道，SQSTM1可被K29、K33、K48和K63連接的多聚泛素鏈修飾。而USP8已被證明可以去除K48、K63、K11和K6連接的泛素鏈。

但作者的結(jié)果證實(shí)：USP8可以顯著抑制WT和K11泛素鏈的泛素化，較小程度上抑制K48和K63泛素化，對其他的泛素鏈無影響（圖3a）。

在敲除USP8的細(xì)胞中，只有K11鏈接的泛素鏈中SQSTM1泛素化顯著上調(diào)（圖3b），而USP8敲低并沒有增加細(xì)胞中內(nèi)源性SQSTM1的K63和K48連接的多泛素化（圖3c）。

得出結(jié)論，USP8會優(yōu)先從SQSTM1中去除K11鏈接的泛素綴合物。

Fig4：USP8主要在K420位點(diǎn)去泛素化SQSTM1：

前期質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)SQSTM1上有多個泛素化位點(diǎn)，包括PB1和UBA結(jié)構(gòu)域內(nèi)的賴氨酸殘基。接下來作者想判斷SQSTM1的哪些賴氨酸殘基可能受到USP8的影響。有報道稱，UBA結(jié)構(gòu)域中的K420殘基是SQSTM1上的主要泛素化位點(diǎn)。K420的泛素化增強(qiáng)了SQSTM1的隔離活性和選擇性自噬。因此，作者開始研究USP8對K420泛素化的影響。

與野生型SQSTM1相比，SQSTM1K420R突變體上附著的HA-Ub數(shù)量顯著減少，但USP8過表達(dá)對SQSTM1K420R突變體的泛素化沒有明顯影響。在敲除USP8的細(xì)胞中，只有K11鏈接的泛素鏈中SQSTM1泛素化顯著上調(diào)（圖4a）。正如預(yù)期的那樣，USP8過表達(dá)對K48或K63連接的SQSTM1K420R的泛素化沒有顯著影響。

KEAP1 (kelch-like ECH-associated protein 1)最近被證明在K420處泛素化SQSTM1，以增強(qiáng)SQSTM1的螯合活性和自噬降解。作者試圖確定USP8是否與KEAP1競爭SQSTM1在K420位點(diǎn)的泛素化。USP8過表達(dá)抑制了KEAP1過表達(dá)引起的野生型SQSTM1的泛素化作用。這種效應(yīng)在SQSTM1K420R突變體中沒有觀察到(圖4c)。因此，USP8拮抗KEAP1使SQSTM1在K420位點(diǎn)泛素化。總的來說，這些結(jié)果表明USP8主要去除SQSTM1在K420位點(diǎn)的泛素化。

Fig5：USP8抑制SQSTM1的自噬降解：

有報道稱，SQSTM1的K420處泛素化可增強(qiáng)SQSTM1的隔離活性和自噬降解。前面已經(jīng)驗(yàn)證了USP8在K420殘基上去泛素化SQSTM1。作者推斷USP8可能有調(diào)控SQSTM1的自噬降解的作用。

通過過表達(dá)USP8和敲降，還有分析SQSTM1蛋白的半衰期，作者發(fā)現(xiàn)USP8在維持SQSTM1蛋白的穩(wěn)定性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。而SQSTM1的降解主要是通過自噬介導(dǎo)的，因此自噬途徑的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞中SQSTM1蛋白的積累。

但USP8敲除并沒有導(dǎo)致自噬缺失的ATG7-/- mef中SQSTM1蛋白水平的降低。這些結(jié)果表明USP8可以保護(hù)SQSTM1免受自噬降解。

Fig6：USP8負(fù)調(diào)控自噬：

SQSTM1在其UBA域的K420位點(diǎn)泛素化增強(qiáng)了SQSTM1介導(dǎo)的泛素化載體招募到自噬體進(jìn)行降解。SQSTM1是一種眾所周知的選擇性自噬底物，SQSTM1的減少被認(rèn)為是自噬通量增加的指標(biāo)。USP8在K420位點(diǎn)去泛素化SQSTM1并抑制其自噬降解，提示USP8可能在自噬小體的形成和自噬通量中發(fā)揮重要作用。

場外：BafA1可阻止自噬體-溶酶體融合，隨后導(dǎo)致LC3-II的積累，它與自噬體膜緊密結(jié)合，并作為自噬的標(biāo)志。

BafA1導(dǎo)致了LC3-II的累積，過表達(dá)USP8降低了LC3-II的累積（圖6a）。敲低USP8，細(xì)胞中LC3-II的水平升高（圖6b）。而在硼替佐米處理后，USP8敲除的HeLa細(xì)胞比對照組的細(xì)胞產(chǎn)生了更大的SQSTM1聚集物（圖6c）。USP8敲低顯著增加了自噬溶酶體的形成，這表明USP8敲除顯著增加了自噬溶酶體的形成(圖6d)。總的來說，這些結(jié)果表明USP8是基礎(chǔ)自噬的負(fù)調(diào)控因子。

Fig7：USP8通過直接去泛素化SQSTM1的K420來調(diào)節(jié)SQSTM1的降解和自噬：

自噬的激活可以誘導(dǎo)SQSTM1降解，USP8可能通過調(diào)節(jié)其他底物影響SQSTM1降解和自噬。接下來，作者嘗試研究USP8是否通過在K420位點(diǎn)去泛素化SQSTM1來影響SQSTM1蛋白水平和自噬。

敲除USP8對sqstm1?/-mef中的LC3-II水平無顯著影響（圖7a）；而USP8過表達(dá)并沒有明顯改變這些細(xì)胞中SQSTM1K420R突變體中LC3-II的水平。這些結(jié)果表明，USP8通過在K420使SQSTM1去泛化來調(diào)節(jié)SQSTM1的活性和自噬。

好了，以上就是本期文章的全部內(nèi)容了~

你看懂了嗎？

沒看懂沒關(guān)系，先收藏起來

等到下次寫標(biāo)書的時候

再好好參考

我們下期再見~