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（一）基因敲除（Knock - out）策略

原理：

CRISPR - Cas9 系統(tǒng)中的 Cas9 蛋白是一種核酸內(nèi)切酶，它在向?qū)?RNA（gRNA）的引導(dǎo)下，能夠識別并結(jié)合到目標(biāo)基因的特定 DNA 序列上。Cas9 蛋白會在目標(biāo) DNA 序列上產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制會對 DSB 進(jìn)行修復(fù)，在非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)過程中，常常會引入插入或缺失（indels）突變。這些突變可能會導(dǎo)致基因閱讀框發(fā)生改變，產(chǎn)生移碼突變，從而使基因功能喪失。

應(yīng)用場景

①用于研究基因功能：以在研究腫瘤相關(guān)基因為例，可以通過 CRISPR - Cas9 敲除某個疑似致癌基因，觀察細(xì)胞表型變化，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等能力的改變，從而確定該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

②構(gòu)建疾病模型：以神經(jīng)退行性疾病為例，可以在動物模型（如小鼠）中敲除與疾病相關(guān)的基因，如阿爾茨海默病相關(guān)的 APP 基因，模擬疾病的發(fā)生過程，為研究疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)

示例

我們想要敲除小鼠胚胎干細(xì)胞中的 Oct4 基因，該基因?qū)S持干細(xì)胞的多能性很重要。因此我們可以設(shè)計針對 Oct4 基因的 gRNA，將其與 Cas9 蛋白一起導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞。Cas9 在 gRNA 引導(dǎo)下在 Oct4 基因的特定位置切割 DNA，細(xì)胞通過 NHEJ 修復(fù)產(chǎn)生突變，最終導(dǎo)致 Oct4 基因功能喪失，干細(xì)胞失去多能性。
（二）基因敲入（Knock - in）策略
原理

基于 CRISPR - Cas9 產(chǎn)生的雙鏈斷裂，利用細(xì)胞的同源重組（HR）修復(fù)機(jī)制來實現(xiàn)基因敲入。在提供含有目的基因片段的供體 DNA 模板的情況下，細(xì)胞可以以該模板為參照，將目的基因整合到基因組的目標(biāo)位置。這個供體 DNA 模板兩側(cè)需要有與目標(biāo)基因組切割位點兩側(cè)同源的序列，以引導(dǎo)同源重組的發(fā)生。
應(yīng)用場景
    ①基因治療：對于一些單基因遺傳病，如鐮狀細(xì)胞貧血，其病因是 β - 珠蛋白基因發(fā)生突變?？梢岳?CRISPR - Cas9 將正常的 β - 珠蛋白基因敲入患者自身造血干細(xì)胞的基因組中，使這些干細(xì)胞能夠產(chǎn)生正常的血紅蛋白，從而治療疾病。
    ②構(gòu)建基因表達(dá)模型：可以將帶有特定標(biāo)簽（如熒光蛋白基因）的序列敲入目標(biāo)基因的特定位置，通過觀察熒光信號來研究目標(biāo)基因的表達(dá)模式和定位
示例
    在果蠅研究中，為了研究特定基因在神經(jīng)元中的表達(dá)情況，將綠色熒光蛋白（GFP）基因敲入目標(biāo)基因的起始密碼子附近。通過 CRISPR - Cas9 系統(tǒng)在目標(biāo)基因位置產(chǎn)生雙鏈斷裂，同時提供含有 GFP 基因以及與目標(biāo)基因切割位點兩側(cè)同源序列的供體 DNA。在 HR 修復(fù)過程中，GFP 基因整合到目標(biāo)基因位點，使果蠅神經(jīng)元中表達(dá)的目標(biāo)基因帶有 GFP 標(biāo)簽，方便觀察神經(jīng)元中該基因的表達(dá)和分布。
  （三）基因激活（Activation）或抑制（Repression）策略

原理

激活策略：通過改造 Cas9 蛋白形成激活型 Cas9（dCas9 - activator），dCas9 蛋白失去了核酸內(nèi)切酶活性，但可以在 gRNA 引導(dǎo)下結(jié)合到目標(biāo)基因的啟動子區(qū)域。同時，dCas9 - activator 融合轉(zhuǎn)錄激活因子，如 VP64 等，這些激活因子可以招募 RNA 聚合酶等轉(zhuǎn)錄機(jī)器，從而促進(jìn)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄激活。

抑制策略：構(gòu)建抑制型 Cas9（dCas9 - repressor），它可以結(jié)合到目標(biāo)基因的啟動子或編碼區(qū)域，通過干擾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或阻礙 RNA 聚合酶的移動等方式來抑制基因的轉(zhuǎn)錄。
應(yīng)用場景

①研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：在細(xì)胞分化過程中，許多基因的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控。通過激活或抑制某些關(guān)鍵基因，可以研究它們對下游基因表達(dá)和細(xì)胞分化方向的影響。

②藥物靶點篩選：對于一些疾病相關(guān)基因，可以通過激活或抑制這些基因來觀察細(xì)胞表型變化，篩選可能的藥物靶點。
示例

在干細(xì)胞分化研究中促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，利用 dCas9 - activator 靶向心肌細(xì)胞特異性基因（如 Myh6）的啟動子區(qū)域，激活該基因的表達(dá)。且結(jié)合其他信號通路的調(diào)節(jié)，引導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞方向分化，為心肌細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)研究提供策略。

ok，本篇文章就到這里，現(xiàn)在了解一些關(guān)于基因編輯技術(shù)的應(yīng)用了嗎？