小編看本文的時(shí)候有點(diǎn)艱辛吃力，本著學(xué)習(xí)的態(tài)度，想深入了解作者前期研究。

真是不看不知道，一看嚇一跳~~~

這這這這。。。這算是這位大神的低分之作

我我我我，我竟然都有點(diǎn)耍不明白了！

咱也不BB了，一起來(lái)拜讀一下大神的“低分”之作吧。

先看結(jié)論！（如圖）

★ERK 通路的激活使 METTL3 和 WTAP 磷酸化。

★METTL3 的磷酸化增加了與 USP5 的相互作用，減少了泛素化，因此穩(wěn)定m[6]A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物促進(jìn)m[6]A。

★ERK/METTL3/WTAP 信號(hào)軸的激活促進(jìn)干細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生。

通俗演繹就是：

ERK活化后促進(jìn)腫瘤發(fā)生！

問(wèn)：為什么會(huì)這樣呢？

答：因?yàn)槎嗄苻D(zhuǎn)錄本衰變！

問(wèn)：為什么會(huì)衰變呢？

答：因?yàn)樵黾恿薽[6]A修飾！

問(wèn)：為什么會(huì)增加m[6]A修飾呢？

答：因?yàn)榧谆D(zhuǎn)移酶復(fù)合物形成了！

問(wèn)：為什么會(huì)形成呢？

答：因?yàn)镸ETTL3/WTAP磷酸化了！

問(wèn)：?jiǎn)柺裁磿?huì)磷酸化呢？

答：因?yàn)镋RK激活了它們！

問(wèn)：為什么ERK會(huì)激活它們呢？

...再問(wèn)我打人了?。?/span>

要理清楚本文的研究思路，就先要知道（去）磷酸化、（去）泛素化、 m[6]A 這幾個(gè)關(guān)鍵詞。

咱們生物狗子都知道，中心法則是一切基礎(chǔ)研究的生命之源。

本文的涉及的：

◆ m[6]A 發(fā)生在mRNA轉(zhuǎn)錄后，決定mRNA的穩(wěn)定、翻譯或降解。

◆（去）磷酸化發(fā)生在蛋白翻譯后，決定蛋白質(zhì)的活化狀態(tài)。

◆（去）泛素化發(fā)生在蛋白翻譯后，決定蛋白質(zhì)的降解或存留。

最終行駛生命活動(dòng)的單位是蛋白質(zhì)，但在蛋白質(zhì)前還有基因組的轉(zhuǎn)錄（主要為表觀調(diào)控）、轉(zhuǎn)錄后的修飾（m[6]A、m[5]C等）、可變剪切（外顯子跳躍、5端或3端內(nèi)含子保留等導(dǎo)致的各轉(zhuǎn)錄本的形成）、成熟加工（pri-pre-matur的過(guò)程調(diào)節(jié)）、再到RNA翻譯為不同的蛋白形式。但蛋白在不同修飾狀態(tài)下還會(huì)有不同的生物學(xué)功能，如磷酸化、甲基化乙?；?、糖基化、泛素化、二聚化、多聚化...

等 ...

我們捋一下本文的Result

Fig1. ERK 激活促進(jìn) mRNA m[6]A 甲基化

先看個(gè)背景知識(shí)補(bǔ)充，方便理解Fig1

2015年有文獻(xiàn)報(bào)道含有IRES的circRNAs能夠在真核細(xì)胞內(nèi)編碼蛋白，接著又發(fā)現(xiàn)了不含IRES的陰性對(duì)照組circRNAs也能在人類(lèi)細(xì)胞中翻譯！此類(lèi)不含IRES能夠翻譯的circRNAs有共同的GGACU的序列特征，推斷甲基化驅(qū)動(dòng)翻譯。

☆1A：為了鑒定m[6]A RNA甲基化的調(diào)節(jié)因子，在 HeLa 細(xì)胞中使用了包含共有 GGACU 基序的環(huán)狀RNA GFP報(bào)告基因。 GFP 前體 mRNA轉(zhuǎn)錄物通過(guò)反向剪接組裝以生成連接 GFP 的兩個(gè)外顯子片段的環(huán)狀 RNA，如圖 1A 所示。 m[6] 環(huán)狀 RNA 上 GGACU 基序的甲基化可以驅(qū)動(dòng) GFP 轉(zhuǎn)錄物的翻譯起始，產(chǎn)生 GFP 熒光信號(hào)。因此，來(lái)自該環(huán)狀 RNA 報(bào)告基因的GFP信號(hào)可用作 m[6]A 甲基化的讀數(shù)。

☆1B: 針對(duì)19,050 個(gè)基因和1,864 個(gè) microRNA (miRNA) 進(jìn)行了基于 CRISPR 敲除的基因組篩選。將 CRISPR 敲除文庫(kù)與 circRNA m[6]A-GFP 報(bào)告基因相結(jié)合，可以篩選 m[6]A 甲基化的可能調(diào)節(jié)因子。敲除促進(jìn)或抑制 m[6]A 甲基化的基因?qū)⒎謩e減少或增加 GFP 轉(zhuǎn)錄本的翻譯。作者收集了具有 GFP 表達(dá)的最多和最低 5% 的細(xì)胞，然后進(jìn)行高通量測(cè)序以分別鑒定 m[6]A 甲基化的負(fù)調(diào)節(jié)因子和正調(diào)節(jié)因子。

☆ 1C: 正如預(yù)期的那樣，METTL3 的敲除導(dǎo)致屏幕中的 GFP 信號(hào)較低。

☆ 1C-D: 低 GFP 表達(dá)細(xì)胞中 gRNA 的通路富集分析RAS 和 MAPK信號(hào)通路的基因最多。

補(bǔ)充圖中發(fā)現(xiàn)：m[6]A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物 (METTL3-METTL14-WTAP) 的過(guò)表達(dá)降低了野生型 RRACT 但不降低突變型 RRTCT 報(bào)告基因的表達(dá)。為了確定 ERK 如何激活 m[6]A 甲基化，作者首先測(cè)試了 ERK 是否與 mRNA m[6]A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物相互作用。免疫共沉淀表明，在 BRAF 轉(zhuǎn)染后，METTL3 與 ERK1 和 ERK2 結(jié)合（圖 S2A）。

Fig2. ERK 磷酸化 METTL3 和 WTAP

Trametinib ： MEK抑制劑，是一種高特異性的，有效的MEK1/2抑制劑，可激活自噬并誘導(dǎo)凋亡。

A375 細(xì)胞：是一種由于 BRAF V600E 突變而具有組成型活性 ERK 的人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞系。

☆ 2A ：在 A375 細(xì)胞中觀察到內(nèi)源性 ERK2 與 METTL3 和 WTAP 的相互作用，A375 細(xì)胞是一種由于 BRAF V600E 突變而具有組成型活性 ERK 的人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞系（圖 2A）。

☆ 2B ： ERK 使用一個(gè)共同的對(duì)接域 (CD)與 D 域結(jié)合（K/R0–2-X1–6-φ-X- φ) 或綁定到 F 域 (FX-F/YP)。使用真核線性基序數(shù)據(jù)庫(kù) (http://elm.eu.org) 的分析顯示 METTL3 中的殘基 415-421 和 WTAP 中的殘基 71-77 是潛在的保守 D 域。

☆ 2C: ERK2 的 CD 突變體（321N）解除了 METTL3 和 WTAP 的相互作用，而 FRS 突變體（263A）沒(méi)有。免疫共沉淀 (co -IP) 顯示 ERK2 僅與 D 域所在的 myc 標(biāo)記域結(jié) 合（圖 S2D）。這些結(jié)果支持 ERK 與 METTL3 和 WTAP 的交互。

☆ （圖 S2F）進(jìn)一步驗(yàn)證了 METTL3 是否是 ERK 的底物。體外激酶測(cè)定表明 ERK 直接磷酸化 METTL3。

☆ 2D-F：質(zhì)譜分析表明 ERK 磷酸化METTL3 在三個(gè)高度保守的殘基： S43、S50 和 S525。突變分析進(jìn)一步證實(shí)這三個(gè)位點(diǎn)是主要的 ERK 磷酸化位點(diǎn)（圖 2F）。【圖中 3A 組：指 METTL3所有三個(gè)磷酸化絲氨酸位點(diǎn)都被丙氨酸取代】

☆ 2G-H ：為了確定 WTAP 的磷酸化位點(diǎn)，檢測(cè)了 S/TP 基序的突變是否影響 ERK 誘導(dǎo)的磷酸化。在人類(lèi) WTAP 的三個(gè) S/TP 基序中，我們發(fā)現(xiàn) S306 和 S341 是人類(lèi) WTAP 的主要 ERK 磷酸化位點(diǎn)。

接下來(lái)作者探討了 ERK 誘導(dǎo)的磷酸化如何增加 RNA m[6]A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的活性。

Fig3. ERK 介導(dǎo)的 METTL3 穩(wěn)定需要 USP5

在分子生物學(xué)中放線菌酮可被用來(lái)確定蛋白質(zhì)（酶）的半衰期。使用放線菌酮處理細(xì)胞，然后使用western blot實(shí)驗(yàn)來(lái)顯示要被研究的蛋白質(zhì)隨時(shí)間的數(shù)量變化。由于放線菌酮阻礙蛋白質(zhì)的合成，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)不斷減少。

☆ 3A ： METTL3 在 mESC 和人 A375 細(xì)胞中WT組始終比 3A 組更高的表達(dá)水平， WTAP也是WT組比2A組始終表達(dá)高。這一觀察結(jié)果提出了一個(gè)假設(shè)，其中 ERK 使 METTL3 磷酸化穩(wěn)定了蛋白質(zhì)，這可以解釋更好的ERK 激活觀察到 METTL3 蛋白水平和 m[6]A 甲基化活性升高。

☆ 在補(bǔ)充圖里研究了 ERK 激活是否會(huì)影響 METTL3 穩(wěn)定性，用ERK抑制劑 PD0325901 處理8h，增加了蛋白的泛素化（圖 S3A）。

☆ 3B ： 3A 組的 METTL3的泛素化水平也高于 WT 組。

☆ 3C：為了更直接地評(píng)估 ERK 對(duì) METTL3 穩(wěn)定性的影響，使用放線菌酮抑制蛋白質(zhì)合成，并監(jiān)測(cè) METTL3 蛋白質(zhì)降解情況。如圖 3C 所示， ERK 激活增加了 WT 的穩(wěn)定性，但沒(méi)有增加不可磷酸化的 3A METTL3 ；與 WT METTL3 相比，磷酸化模擬物 3E METTL3 顯示出穩(wěn)定性的增加。

為了進(jìn)一步了解 ERK 磷酸化如何降低 METTL3 泛素化，補(bǔ)充圖中發(fā)現(xiàn) USP5 和 USP1的敲低降低了 A375 細(xì)胞中的 METTL3（圖 S4B）。市售的 USP1 抑制劑 SJB3-019A 和 USP5 抑制劑 EOAI3402143 (EOAI) 也降低了 METTL3（圖 S4C）?？紤]到 USP5 涉及廣泛的病理過(guò)程，并且對(duì) METTL3 的影響最顯著，選擇進(jìn)一步研究它。

☆ 3D ：隨后研究了在活化的 BRAF 存在下 METTL3 的磷酸化是否會(huì)影響 METTL3-USP5 相互作用。作者注意到 ERK 激活增加了 METTL3 和 USP5 之間的相互作用，這種相互作用隨著磷酸缺陷突變體 S43A、S50A、S525A 變?nèi)?，并在所有三個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生突變時(shí)完全減弱。 3E METTL3 與 USP5 的結(jié)合更強(qiáng)。 BRAF 表達(dá)也進(jìn)一步促進(jìn)了 3E METTL3-USP5 相互作用并增加了其表達(dá)。這表明 BRAF 也可能影響 USP5 活性。

因?yàn)?USP5 是一種可以阻止蛋白質(zhì)泛素化的酶，進(jìn)一步驗(yàn)證了 USP5 是否通過(guò)去泛素化穩(wěn)定 METTL3。

☆ 3E ： WT 組（過(guò)表達(dá) USP5 ）比 C335A 組（過(guò)表達(dá)突變的 USP5 ）降低了泛素化并穩(wěn)定了 METTL3。

☆ 3F：找到抑制 USP5 而誘導(dǎo) METTL3 的降解的泛素連接酶，作者搜索了共識(shí)基序和物理關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)以及基于 CRISPR 的基因組篩選。 METTL3 包含 SPOP 結(jié)合共識(shí)基序和 COP1 結(jié)合破壞基序 (http://elm.eu.org)。它還與 TRIM28、HUWE1 和 UBR5 (https://thebiogrid.org) 相互作用，并且可能被 SMURF1 (
http://ubibrowser.ncpsb.org) 泛素化。從 CRISPR 篩選中鑒定出 FBXW8、FBXW12、SPOPL、TRIM2 和 ANAPC1 作為 m[6]A 甲基化的負(fù)調(diào)節(jié)因子。為了找到參與 METTL3 降解的泛素連接酶，用靶向泛素連接酶的小干擾 RNA (siRNA) 進(jìn)一步轉(zhuǎn)染 USP5 敲低的 A375 細(xì)胞。敲除 SPOP、TRIM28 或 ANAPC1 部分消除了 USP5 抑制介導(dǎo)的 METTL3 降解。

總之，這些結(jié)果表明 USP5 通過(guò)去泛素化穩(wěn)定 METTL3

Fig4. ERK 對(duì) METTL3/WTAP 的磷酸化促進(jìn) 細(xì)胞分化

mESC：小鼠胚胎干細(xì)胞

據(jù)報(bào)道，自分泌 FGF4 是 mESC 中 ERK 信號(hào)傳導(dǎo)的主要刺激物。FGFR 或 ERK 活性的干擾阻礙了 mESCs 進(jìn)行分化和保留多能性因子（包括 Nanog）表達(dá)的能力。

作者觀察到 p-43 METTL3 磷酸化被 FGF4 增強(qiáng)并被 MEK 抑制劑 PD0325901 或 FGFR1 抑制劑 PD173074 降低（圖 S5A）。因?yàn)閾?jù)報(bào)道， mESCs 在分化時(shí)退出多能狀態(tài)需要 ERK 激活和 METTL3 表達(dá)，因此作者進(jìn)一步研究了 METTL3/WTAP 的磷酸化是否影響 mESC 命運(yùn) 。

☆ 4A ：將 TetOn-shWTAP 引入 METTL3 敲除 (KO) 的 mESC 以調(diào)整內(nèi)源性 WTAP 表達(dá)。然后用 WT 或磷酸失活突變體 CuO-METTL3-T2A-WTAP 轉(zhuǎn) 染細(xì)胞。通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ LC-MS/MS ）對(duì) m[6]A 的定量顯示出 3A METTL3 和 2A WTAP 的協(xié)同減少。

☆ 4B ： R-3A2A mESCs 表現(xiàn)出更高的增殖增加和階段特異性胚胎抗原 1 (SSEA-1) 表達(dá)（圖 S5C）。這些觀察結(jié)果支持 METTL3 和 WTAP 磷酸化的喪失將 mESC 維持在多能狀態(tài)的觀點(diǎn)。

☆ 4C ： m[6]A 甲基化多能性因子轉(zhuǎn)錄本，包括 Nanog、Zfp42、Klf2、Sox2 和 Lefty1。不含任何 m[6]A 修飾的 Pou5f1 也用作陰性對(duì)照。 m[6]A-RIP-qPCR 證實(shí) m[6]A 減少，qRT-PCR 表明這些 m[6]A 標(biāo)記的多能性轉(zhuǎn)錄本在 R-3A2A mESC 中上調(diào)（圖 4D）。

☆ 4E ： R-3A2A mESCs 未能抑制多能基因，并充分上調(diào)發(fā)育標(biāo)記物的指標(biāo)。

這些結(jié)果支持 METTL3 和 WTAP 的 ERK 依賴性磷酸化促進(jìn) mESC 分化的觀點(diǎn)。

Fig5-6. 受 mESC 中甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物磷酸化影響的轉(zhuǎn)錄本

為了進(jìn)一步了解 m[6]A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的磷酸化如何影響 m[6]A 修飾的轉(zhuǎn)錄本，作者繪制了 mESC 中的 m[6]A 甲基化組。

☆5A ： R-WT 與 R-3A2A mESC 的比較揭示了甲基化位點(diǎn)的整體丟失。

☆ 5B-C：使用作者內(nèi)部 R 包“MeRIPtools”：它使用基于二項(xiàng)分布的模型測(cè)試 m[6]A IP 富集；發(fā)現(xiàn) 7,591 m[6]A 峰顯示 R-3A2A 細(xì)胞顯著減少與 R-WT 細(xì)胞相比，例如 Nanog、Lefty1 和 Zfp219 中的修飾位點(diǎn)（圖 5C）。

☆ 5D-F： GO分析， m[6]A 甲基化降低（圖 5D）和差異表達(dá)（圖 5E）的轉(zhuǎn)錄本富集了與多能性和 mRNA 加工相關(guān)的基因。重要的是，與 R-WT mESCs 相比，許多參與多能性的基因在 R-3A2A 細(xì)胞中顯示出降低的 m[6]A 甲基化（圖 5F）。

☆ 6A-B ：正如預(yù)期的那樣，m[6]A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物在 R-3A2A A375 細(xì)胞中的穩(wěn)定性降低，這導(dǎo)致 mRNA 的整體 m[6]A 水平較低（圖6B）。

☆ 6C-D：發(fā)現(xiàn) MEK 抑制劑 PD0325901 和Trametinib 可減少蛋白質(zhì)A375 黑色素瘤細(xì)胞中 m[6]A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的水平（圖 6C）和整體 mRNA m[6]A 水平（圖 6D）。

☆ 6E ：使用兩種結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的 USP5 抑制劑 EOAI 和 vialinin 來(lái)評(píng)估 USP5 對(duì)黑色素瘤中 METTL3 水平的影響細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)這兩種 USP5 抑制劑增加了 METTL3 的泛素化，導(dǎo)致 METTL3 蛋白水平降低（圖 6E、S7E 和 S7F）。

☆ 6F ： MEK 抑制劑， R-3A2A 或 METTL3-WTAP 敲低可使黑色素瘤和結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì) USP5 抑制敏感（圖 6F 和 S7G），支持 USP5 和 METTL3 之間的聯(lián)系。

最后，考慮到 HER2 表達(dá)使 METTL3 和 WTAP 磷酸化（圖 S1C 和 S7H），并且過(guò)表達(dá) HER2 的 SKBR3 和 BT474 細(xì)胞中的 m[6]A 水平更高（圖 S7I），研究了抑制 HER2 是否會(huì)影響 m[6] ]甲基化。

☆ 6G-H：兩種 HER2 抑制劑，tucatinib 和 lapatinib，可以降低 HER2 陽(yáng)性乳腺癌中 METTL3 蛋白水平和 mRNA m[6]A 甲基化（圖 6G 和 6H）。

總體而言，這些數(shù)據(jù) 支持 ERK 依賴性 METTL3 穩(wěn)定性影響細(xì)胞 mRNA m[6]A 甲基化，這可能有助于腫瘤發(fā)生。

好了文章就到這里了，

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