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普拉特澤生物為廣大生命科學(xué)研究人員提供熒光原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，可根據(jù)實(shí)方案的要求選擇不同的檢測(cè)方法，本文就跟大家一起繼續(xù)探究關(guān)于熒光法探究原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

用原位雜交技術(shù)在原位研究組織細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。

二、實(shí)驗(yàn)樣本及分組

樣本：BC53、BC53B、BC54、BC54B

檢測(cè)指標(biāo)：has-circ-ST6GALNAC6

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.探針工作信息

2. 染色結(jié)果

BC53

BC53B

圖1 染色圖

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素（488）標(biāo)記的綠光。mRNA原位雜交顯示結(jié)果理論為胞漿陽性，少數(shù)核陽性屬正常。micRNA與lncRNA不同指標(biāo)表達(dá)定位不同。根據(jù)表達(dá)量不同熒光亮度有強(qiáng)弱。

五、實(shí)驗(yàn)材料

1.主要耗材

2.主要試劑

六、實(shí)驗(yàn)原理

用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列雜交, 從而對(duì)組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析?；驹?/span>--堿基互補(bǔ)配對(duì)原理。

七、實(shí)驗(yàn)步驟

1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

3、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h。

4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-無水乙醇Ⅰ 5min-無水乙醇Ⅱ 5min，風(fēng)干，DEPC水浸泡。

5、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短，切片于修復(fù)液中煮沸10分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

6、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H₂O₂，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

7、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

8、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針has-circ-ST6GALNAC6 probe 雜交液，濃度6ng/ul，恒溫箱37度雜交過夜。

9、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

10、滴加封閉液：滴加封閉血清（正常兔血清），室溫30min。

11、滴加鼠抗地高辛標(biāo)記過氧化物酶（anti-DIG-HRP）：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min，后PBS洗3次×5min。

12、滴加FITC-TSA：滴加FITC-TSA試劑，避光室溫反應(yīng)5min。后TBST洗3次×10min，PBS洗1次×5min。

13、DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

14.鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm,發(fā)藍(lán)光；FAM(488)綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm，發(fā)綠光；CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光。）

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