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細胞凍存與復蘇的操作步驟與注意事項由普拉特澤生物跟大家一起詳細學習。細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，是將細胞放在低溫環(huán)境，減少細胞代謝，以便長期儲存的一種技術。普拉特澤生物細胞實驗平臺提供多種細胞實驗代做與細胞質粒購買的服務，擁有自己的的細胞庫，所有細胞的凍存與復蘇是非常重要的常規(guī)操作，從未出現(xiàn)一例細胞保存相關的失誤和錯誤。多年操作中也總結出了自己的一套細胞凍存與復蘇操作的詳細步驟與注意事項，今天傳授給大家，建議全文背誦~

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。那現(xiàn)在我們來看看細胞凍存與復蘇的操作步驟：

一、細胞凍存的詳細操作步驟

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；

2. 取對數(shù)生長期的細胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗。

3. 去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長的細胞消化下來；

4. 離心1000rpm，5min；

5. 去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；

6. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

7. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；

8. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

細胞凍存

二、細胞復蘇的詳細操作步驟

1. 提前打開水浴鍋，將水溫調至37℃，將需要用到的培養(yǎng)基放入水浴鍋預熱。

2. 復蘇時，將凍存細胞放入水浴鍋中快速搖晃使細胞在1~2min內迅速解凍。

3. 準備一只15ml離心管，加入5ml培養(yǎng)基，將解凍后的細胞懸液吸出放入到離心管內混勻，

蓋上蓋子，放入離心機內，1000rpm離心5min。

4. 離心完畢，用移液槍小心吸去上清，加入1mL培養(yǎng)基重懸細胞。

5. 將細胞懸液轉移至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，補充適量培養(yǎng)基，將細胞吹打均勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

6. 這樣我們就完成了細胞的復蘇的流程，復蘇后的細胞通常在24小時內會貼壁，第二天我們取出細胞便可以在顯微鏡下觀察細胞的狀態(tài)。

細胞復蘇

三、細胞凍存與復蘇操作的注意事項

1. 取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

2. 凍存液：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷。

3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。

4. 細胞貼壁少：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液，而在我的試驗中的經驗總結為培養(yǎng)基越少細胞越容易貼附。

6. 復蘇細胞分裝：復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。

7. 加培養(yǎng)基的量：加培養(yǎng)基的量主要和DMSO的濃度相關，如果加培養(yǎng)基的太少，DMSO的濃度就會比較大，會影響細胞生長。從文獻資料上看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有影響。還有一個說法是1％，所以如果凍存液的濃度是 10％DMSO，那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。

好啦，那關于細胞凍存與復蘇的詳細操作步驟與注意事項咱們就介紹到這里啦，如果您有細胞實驗外包與細胞購買的需求的話歡迎留言，細胞實驗平臺的技術會及時給到回復的哦！

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