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    巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)中細(xì)胞分離與培養(yǎng)的具體步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，普拉特澤生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)專業(yè)承接細(xì)胞誘導(dǎo)/分化外包、細(xì)胞焦亡等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)，積累專業(yè)豐富的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)。

在巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)中，細(xì)胞分離與培養(yǎng)的具體步驟可以細(xì)分為以下幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以下是根據(jù)權(quán)威來源整理的詳細(xì)步驟：

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

?1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑?

①選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如SPF級(jí)小鼠，體質(zhì)量通常在18～22g，雄性，6～8周齡。

②準(zhǔn)備必要的試劑，包括細(xì)胞培養(yǎng)基（如RPMI 1640）、胎牛血清（FBS）、雙抗（抗生素和抗真菌劑）、紅細(xì)胞裂解液、PBS（磷酸鹽緩沖液）、以及用于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，如M-CSF（巨噬細(xì)胞集落刺激因子）。

?2. 實(shí)驗(yàn)器械?

一次性注射器、手術(shù)器械（如眼科剪、眼科鑷）、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、移液槍及槍頭等，并確保所有金屬器械經(jīng)過高壓滅菌，離心管輻照消毒。

二、細(xì)胞分離

腹腔巨噬細(xì)胞分離

?1. 腹腔注射刺激物?

在實(shí)驗(yàn)前三天，每天給小鼠腹腔注射1mL的3%巰基乙酸鹽肉湯，以刺激巨噬細(xì)胞增殖。

?2. 處死小鼠并收集腹腔液?

⑴采用脫頸法處死小鼠，將小鼠浸泡在75%乙醇中滅菌3-5分鐘，然后移至超凈工作臺(tái)。

⑵用預(yù)冷的PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗腹腔，輕輕按摩小鼠腹部數(shù)次，使液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)。

⑶抽取腹腔液，收集至離心管中，并重復(fù)沖洗腹腔以增加細(xì)胞收集量。

?3. 細(xì)胞分離與純化?

⑴將收集的腹腔灌洗液在常溫條件下以1000rpm/min離心10分鐘，棄去上清。

⑵用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

⑶將細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2～3小時(shí)，使巨噬細(xì)胞貼壁。

⑷棄去未貼壁的細(xì)胞，余下的貼壁細(xì)胞即為腹腔巨噬細(xì)胞。

骨髓巨噬細(xì)胞分離

?1. 提取骨髓細(xì)胞?

①處死小鼠后，用剪刀和鑷子取出其雙側(cè)股骨和脛骨，剔除附著的肌肉和組織。

②將骨骼浸泡在75%乙醇中滅菌后，用冷的PBS清洗。

③使用注射器吸取含有M-CSF的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液。

?2. 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化?

①將骨髓細(xì)胞懸液過篩后離心，去除紅細(xì)胞和雜質(zhì)。

②用含有M-CSF的誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

③在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換新鮮培養(yǎng)基。

④培養(yǎng)7天后，收集貼壁的骨髓巨噬細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、細(xì)胞培養(yǎng)

?1. 細(xì)胞貼壁與換液?

巨噬細(xì)胞貼壁后，需定期更換新鮮的培養(yǎng)基以維持細(xì)胞生長環(huán)境。

每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，并在更換前用PBS清洗細(xì)胞以去除死細(xì)胞和雜質(zhì)。

?2. 細(xì)胞形態(tài)觀察?

使用倒置顯微鏡定期觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)。

巨噬細(xì)胞通常呈規(guī)則圓形或不規(guī)則形狀，貼壁較快且具有較強(qiáng)的吞噬能力。

?3. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與活性檢測(cè)?

⑴使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞活性。

⑵細(xì)胞活性檢測(cè)通常使用臺(tái)盼藍(lán)染色法，通過計(jì)算活細(xì)胞與總細(xì)胞的比例來評(píng)估細(xì)胞活性。

通過以上步驟，可以成功分離并培養(yǎng)出高質(zhì)量的巨噬細(xì)胞原代細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的細(xì)胞來源。

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