Western blot檢測(cè)_蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)步驟及視頻教程
2022-02-18 16:08:31
來(lái)源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
本文由普拉特澤生物旗下生物科研培訓(xùn)品牌《春風(fēng)學(xué)院》分享，春風(fēng)學(xué)院提供線上視頻課程培訓(xùn)，線下實(shí)操一對(duì)一帶教，是你快速掌實(shí)驗(yàn)技能的好幫手哦，關(guān)于Western blot檢測(cè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)干貨輸送，篇尾有視頻教程方便大家理解
Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是科研造假的重災(zāi)區(qū)，WB檢測(cè)其操作上手難度也名列前茅，就連大部分實(shí)驗(yàn)老手也飽受折磨，所以想要獲得一張漂亮的WB結(jié)果非常不容易。
相信每個(gè)做WB（蛋白質(zhì)免疫印跡）實(shí)驗(yàn)的高手都有一些自己的獨(dú)門經(jīng)驗(yàn)，而普拉特澤生物做為依托互聯(lián)網(wǎng)從事線上實(shí)驗(yàn)服務(wù)外包服務(wù)，并面向全國(guó)承接實(shí)驗(yàn)外包的生物科研公司，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的WB檢測(cè)也承接了數(shù)以千記的的WB實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，積累了大量的WB檢測(cè)案例，為廣告科研工作者提供實(shí)驗(yàn)步驟的教學(xué)與培訓(xùn)服務(wù)。
好了廢話不多說(shuō)上正菜!WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟:
WB檢測(cè)第一步：準(zhǔn)備蛋白樣本
（1）首先在顯微鏡下觀察確保收集健康的、按預(yù)期生長(zhǎng)的wb檢測(cè)的細(xì)胞樣本。
WB檢測(cè)第二步：SDS-PAGE凝膠電泳
(1) 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手用無(wú)塵布輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后晾干。未徹底清潔干凈容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)印跡跑膠痕跡不清晰，wb實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析造成困擾。
(2) 組裝制膠器：玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，加滿純水或蒸餾水進(jìn)行試漏，5 min左右液面不下降即可。
(3) 配制分離膠：根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量來(lái)確定分離膠的濃度。目標(biāo)蛋白的分子量越小，丙烯酰胺/bis 的百分比越高。目標(biāo)蛋白的分子量越大，丙烯酰胺/bis 的百分比越低。按配5%分離膠為例，按下表比例配制好膠液，動(dòng)作盡量迅速。特別注意，TEMED起凝膠作用，所以待一切都準(zhǔn)備就續(xù)再最后加入TEMED，混勻后立即灌膠。灌膠時(shí)，可用10 mL移液器吸取，沿內(nèi)側(cè)玻璃壁緩慢放出，1.5 mm厚的玻璃板灌膠約6-7mL左右。最后在分離膠上加1 mL 75%酒精。
western blot實(shí)驗(yàn) 分離膠的配方
（4） 配制濃縮膠：同樣以配制5％的濃縮膠為例。待分離膠凝固，倒出封液的酒精。按配方配制分離膠，同樣注意最后加入TEMED，而后混勻（不要?jiǎng)×覔u晃，避免產(chǎn)生氣泡）即可灌膠。將板中剩余空間灌滿濃縮膠后將梳子插入濃縮膠中。插梳子時(shí)從一側(cè)傾斜插入，最后使梳子保持水平（避免梳子底下有氣泡）。灌膠時(shí)也要沿玻璃板緩慢流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。
western blot實(shí)驗(yàn) 5%濃縮膠的配方
（5） 上樣：加足夠的電泳緩沖液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣(電泳緩沖液至少要漫過(guò)內(nèi)側(cè)的小玻璃板)。然后平穩(wěn)拔出梳子，速度不宜過(guò)快，避免加樣孔變形。盡量保證每個(gè)加樣孔的形狀一致（可用鑷子將膠撥正）。用10μl移液槍吸取7-10μl樣品緩慢加入加樣孔中（每孔樣品量保持一致，避免條帶長(zhǎng)短不一），根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要在未加樣的任意孔加3μl蛋白marker或同體積的1×Loading buffer。
（6） 電泳：電泳時(shí)電壓為80V，當(dāng)marker進(jìn)入分離膠（可看到不同顏色的marker條帶時(shí)），可將電壓調(diào)整至120V，電泳至溴酚藍(lán)跑至膠底即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
WB檢測(cè)第三步轉(zhuǎn)膜：
（1）轉(zhuǎn)膜需準(zhǔn)備適量濾紙和1張與膠同等大小的PVDF膜。PVDF膜大小需要根據(jù)膠的大小來(lái)裁剪，在裁剪時(shí)注意不要用收直接接觸PVDF膜。切好的PVDF膜還需于甲醇中浸泡10s，再于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min后使用；
（2）在倒有轉(zhuǎn)膜液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子，夾子每邊各墊一層海綿墊及適量濾紙（轉(zhuǎn)膜液的量宜沒(méi)過(guò)夾子）。
（3）用切膠尺撬開(kāi)玻璃板，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕。切去非目的蛋白部分，小心剝下分離膠放置在夾子黑色面，用手或切膠板調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕壓搟去氣泡。將適宜大小的膜覆蓋在膠上搟去氣泡。在膜上蓋濾紙并除去氣泡。將夾子另一面蓋上并夾緊，放入轉(zhuǎn)膜槽，夾子黑色面對(duì)槽的黑面，夾子白色面對(duì)槽的紅面。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行，操作時(shí)盡量避免膠與膜之間有氣泡（轉(zhuǎn)膜液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門以使空氣流通）。
WB檢測(cè)第四步 免疫反應(yīng)：
（1）封閉：將膜移至含有5%脫脂牛奶粉（1×PBST溶解奶粉）封閉液的孵育盒中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h左右
（2）一抗孵育：將一抗用5%BSA稀釋至適當(dāng)濃度（根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整抗體稀釋比）。從封閉液中取出膜，用PBST或水洗去殘留封閉液。將膜放入新的孵育盒，加入稀釋后的一抗，置于4℃冰箱孵育過(guò)夜或室溫?fù)u床孵育1h以上，孵育結(jié)束后，用PBST洗膜。
（3）將二抗用PBST稀釋至適當(dāng)濃度（根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整抗體稀釋比），室溫下孵育1h后（或者37℃恒溫箱孵育10-15min），用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5-10min。
WB檢測(cè)第五步化學(xué)發(fā)光：
（1）根據(jù)wb檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制顯影液。
（2）將孵育完成的膜用鑷子將其平鋪在平板上，移液槍吸取發(fā)光底物，均勻覆蓋膜。
（3）將平板放入顯影儀。
最后就是進(jìn)行整個(gè)western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的拍照與總結(jié)分析啦，回顧整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，詳細(xì)步驟其實(shí)就是：提取細(xì)胞蛋白、BCA定量、制備蛋白膠、蛋白樣本變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗、二抗、顯影、結(jié)果分析。
是不是很簡(jiǎn)單呢？wb檢測(cè)的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟如果您還有實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的疑問(wèn)可以關(guān)注咱們的春風(fēng)學(xué)院——western blot（理論+實(shí)操）篇，或報(bào)名進(jìn)行線下一對(duì)一wb檢測(cè)培訓(xùn)，分WB檢測(cè)理論分析和WB實(shí)驗(yàn)操作演示，進(jìn)行系統(tǒng)性的學(xué)習(xí)實(shí)際操作與結(jié)果分析哦。
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