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Tunel染色實(shí)驗(yàn)的常見問題與解決方法【細(xì)胞凋亡檢測】

大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是TUNEL染色實(shí)驗(yàn)的常見問題與解決方法。普拉特澤生物—病理實(shí)驗(yàn)平臺(tái)承接了大量的TUNEL檢測細(xì)胞凋亡代測實(shí)驗(yàn)與技術(shù)咨詢服務(wù)，同時(shí)在實(shí)操過程中也遇到了很多特殊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，今天小編就把普拉特澤生物技術(shù)在用TUNEL檢測細(xì)胞凋亡時(shí)遇到的各種問題極其解決方法總結(jié)給大家，希望能在實(shí)驗(yàn)的操作中給到大家一定的幫助！

問題一、熒光信號(hào)弱或沒有熒光信號(hào)

原因1：樣本處理不當(dāng)

（1）樣本切片太厚。建議適當(dāng)將切片切薄一點(diǎn)，便于染色。

（2）脫蠟和水化不充分。建議脫蠟先60 oC 20 min，再使用二甲苯兩次5-10 min；而水化用梯度乙醇從高到低濃度浸洗。

（3）Proteinase K的孵育時(shí)間過短。優(yōu)化Proteinase K的孵育時(shí)間，常用時(shí)間10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。

（4）Proteinase K濃度過低。建議蛋白酶K一般工作液濃度為20 μg/mL。

（5）放置在-20 oC保存較長時(shí)間的切片不新鮮，減低染色效率。建議使用新鮮切片。

原因2：染色操作不當(dāng)

（1）染色時(shí)間過短。建議一般 37 °c 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長至2 h，但要結(jié)合背景著色。

（2）TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過低。建議適當(dāng)提高TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度。

（3）TdT酶失活。建議TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會(huì)導(dǎo)致TdT酶失活。

（4）樣本干燥。加上TUNEL反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片/保鮮膜/濕盒中進(jìn)行，保證樣本均勻染色，又可防止反應(yīng)液干燥。

原因3：熒光檢測操作不當(dāng)

主要是因?yàn)?/span>操作未避光。由于熒光易碎滅，建議標(biāo)記與檢測樣本時(shí)，載玻片要避光，觀察時(shí)要盡量快。

問題二、非特異性染色（假陽性高）

原因1：樣本處理不當(dāng)

（1）使用酸性或堿性固定液，導(dǎo)致DNA損傷。建議使用pH中性的固定液固定組織或者細(xì)胞。

（2）固定液濃度過高，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。

（3）固定時(shí)間過長，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議控制固定時(shí)間在4 ℃放置25 min。

（4）蛋白酶K處理時(shí)間過長，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)縮短處理時(shí)間。

（5）蛋白酶K濃度過大，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)調(diào)整蛋白酶K溶液濃度，一般工作液濃度為20 μg/mL。

原因2：染色操作不當(dāng)

（1）TUNEL染色時(shí)間過長。建議一般是 37 °c 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長至2 h，但要結(jié)合背景著色。

（2）未充分清洗樣本。染色后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片的非特異性染色。

問題三、熒光背景強(qiáng)

原因1：樣本操作不當(dāng)

（1）TUNEL染色時(shí)間過長。建議染色時(shí)間適當(dāng)，一般是 37 °c孵育60 min，避免串色。

（2）TUNEL染色液濃度過大。建議增大稀釋倍數(shù)，優(yōu)化濃度。

（3）PBS未充分清洗樣本。在TUNEL反應(yīng)后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片樣本中殘留的染料。

原因2：熒光檢測操作不當(dāng)

曝光時(shí)間過長。建議調(diào)整曝光條件，先對(duì)陰性組調(diào)整到無背景光，然后用這個(gè)曝光條件去拍攝實(shí)驗(yàn)組（可以微調(diào)，但是不需要大調(diào)）。

好啦，那TUNEL染色的幾個(gè)常見問題咱們就介紹到這里啦，您還有遇到其他的問題，歡迎給我們留言，我們會(huì)回答后加到這片文章中跟大家一起學(xué)習(xí)哦！

如果您有用TUNELl或流式代測細(xì)胞凋亡的需求的話，請(qǐng)相信——普拉特澤！

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