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今天給大家分享的就是Southern Blot印跡雜交實驗操作詳細(xì)步驟，上期我們在Southern Blot實驗介紹中簡單介紹了一下關(guān)于Southern Blot實驗的操作步驟，本文就給大家詳細(xì)講講實際操作中的各種細(xì)節(jié)，讓你看完即會！不會普拉特澤幫你做，教你會！

一、 Southern Blot待測核酸樣品的制備

1、制備待測DNA

基因組DNA是從動物組織（或）細(xì)胞制備。1.采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑裂解細(xì)胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA；3.用有機(jī)試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質(zhì)。

2、 DNA限制酶消化

基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶，樣品即可直接進(jìn)行電泳分離，必要時可進(jìn)行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進(jìn)行電泳分離。

二、瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品

1. 制備瓊脂糖凝膠，盡可能薄。

2. 分子質(zhì)量標(biāo)志物（DIG標(biāo)記）上樣。

3. 電泳，使DNA條帶很好的分離。

4. 評價靶DNA的質(zhì)量。在電泳結(jié)束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外燈下觀察凝膠。

三、電泳凝膠預(yù)處理

1. 如果靶序列>5kb，則需進(jìn)行脫嘌呤處理。

(1) 把凝膠浸在0.25mol/L HCl中，室溫輕輕晃動，直到溴酚藍(lán)從藍(lán)變黃。

注意：處理人類基因組DNA≤10分鐘；處理植物基因組DNA≤20分鐘。

(2) 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中

2. 如果靶序列<5kb，則直接進(jìn)行下面的步驟

(1) 把凝膠浸在變性液（0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl）中，室溫2×15分鐘，輕輕晃動。

(2) 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中

(3) 把凝膠浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，pH7.5，1.5mol/L NaCl），室溫2×15分鐘。

(4) 在20×SSC中平衡凝膠至少10分鐘。

四、轉(zhuǎn)膜

將凝膠中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上。而此過程最重要的是保持各DNA片段的相對位置不變。DNA是沿與凝膠平面垂直的方向移出并轉(zhuǎn)移到膜上，因此，凝膠中的DNA片段雖然在堿變性過程已經(jīng)變性成單鏈并已斷裂，轉(zhuǎn)移后各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置仍然一樣，故而稱為印跡（blotting）。

五、探針標(biāo)記

用于Southern印跡雜交的探針可以是純化的DNA片段或寡核苷酸片段。探針可以用放射性物質(zhì)標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記，放射性標(biāo)記靈敏度高，效果好；地高辛標(biāo)記沒有半衰期，安全性好。

六、預(yù)雜交（prehybridizafion）

將固定于膜上的DNA片段與探針進(jìn)行雜交之前，必須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點全部封閉，這就是預(yù)雜交的目的。

（一）配制預(yù)雜交液。

（二）把預(yù)雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預(yù)熱至雜交溫度。

（三）將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個稍寬于濾膜的塑料袋，浸濕濾膜。

（四）將DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。

（五）從塑料袋中除凈2×SSC，加入預(yù)雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。

（六）加入變性的DNA置終濃度200μg/ml。

（七）除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口搖晃數(shù)次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h。

七、Southern雜交

1、將標(biāo)記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。

2、從水浴中取出含有濾膜和預(yù)雜交液的塑料袋，將變性的DNA探針加到預(yù)雜交液中。

3、除去袋中的空氣封住袋口，為避免同位素污染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個未污染的塑料袋內(nèi)。

4、置42℃水浴溫育過夜（至少18h）。

八、洗膜

取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：

2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；

1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；

0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；

0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；

0.1×SSC/0.1% SDS， 56℃，10min。

采用核素標(biāo)記的探針或發(fā)光劑標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交還需注意的關(guān)鍵一步就是洗膜。

九、放射性自顯影檢測

（一）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側(cè)增感屏）。

（二）在暗室內(nèi)，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠代固定，合上暗盒。

（三）將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對X光底片曝光（根據(jù)信號強(qiáng)弱決定曝光時間，一般在1-3天）。

（四）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片（洗片時先洗一張，若感光偏弱，則在多加兩天曝光時間，再洗第二張片子）。（注：注意同位素的安全使用）

好啦，那關(guān)于Southern blot印記雜交飾演的操作步驟我們就介紹完了，如果有幫到您一定要記得普拉特澤生物這個名字哦，您生物科研路上的好盟友（具體可做實驗請戳）。

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