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熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方法由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，普拉特澤生物表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)專(zhuān)業(yè)承接熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)操作中積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也遇到了不計(jì)其數(shù)的問(wèn)題，表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)在一次又一次實(shí)踐中總結(jié)了遇到各種常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決方法。本文就跟大家一起來(lái)看實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)頻率最高的一些問(wèn)題：

1、RNA得率低

原因1：樣品裂解不完全

解決：適當(dāng)選擇起始材料的量，加入合適體積的裂解液。

原因2：勻漿不充分

解決：減少材料的數(shù)量; 根據(jù)材料類(lèi)型選擇合適勻漿方法; 組織樣本適宜切成小塊后，在Trizol試劑中均質(zhì)，充分裂解。

原因3：用于分光光度分析的稀釋液PH值太低

解決：使用TE（PH 8.0）作為稀釋液進(jìn)行讀數(shù)測(cè)定。

2、RNA降解

問(wèn)題1：RNA酶污染

解決：戴上手套操作，勤換手套; 耗材與試劑均應(yīng)作RNase-free處理; 操作中減少EP管的開(kāi)蓋次數(shù)與時(shí)間。

問(wèn)題2：樣品處理不當(dāng)

解決：新鮮組織收獲后，立即凍結(jié)在-70℃或液氮中; 也可以在Trizol試劑中均質(zhì)后，-70℃下儲(chǔ)存。

3、Abs260/Abs280比值低

問(wèn)題1：酸性pH降低吸光度比率

解決：使用TE緩沖液(pH 8.0)作為稀釋液進(jìn)行測(cè)定。

問(wèn)題2：水相被酚相污染

解決：小心轉(zhuǎn)移上層水相，避免吸入中間相，可留少許上層相不吸取。

4、DNA 污染

問(wèn)題1：Trizol加少了，造成DNA /核蛋白復(fù)合物與RNA水相分離不完全

解決：適當(dāng)選擇起始材料的量，加入合適體積的裂解液。

問(wèn)題2：水相被苯酚相污染

解決：小心轉(zhuǎn)移上層水相，避免吸入中間相，可留少許上層相不吸取。

5、下游反應(yīng)中RNA表現(xiàn)不佳

問(wèn)題1：乙醇或鹽類(lèi)污染

解決：溶解RNA之前，注意洗滌沉淀，并通過(guò)空離和風(fēng)干除去殘留。

6、熔解曲線有雜峰

問(wèn)題1：引物二聚體

解決：

（1）提高退火溫度

（2）降低引物濃度，甚至調(diào)整正向引物和反向引物的比例。一般引物最終濃度設(shè)定為200 nM，但如有必要，可降低至60 nM。

（3）鎂離子的濃度最好在3 mM左右。高于這個(gè)濃度，引物二聚體更易形成;

（4）重新設(shè)計(jì)引物并評(píng)估它們的二聚化傾向。

問(wèn)題2：非特異性擴(kuò)增

解決：重新設(shè)計(jì)引物并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估特異性。

問(wèn)題3：cDNA模板降解

解決：模板避免反復(fù)凍融，可適當(dāng)分裝保存，每次取用一小管。

7、無(wú)擴(kuò)增信號(hào)

原因：低表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄，或定量?jī)x器問(wèn)題

好啦！那實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方法咱們就分享到這里啦！希望能幫到大家哦，如果您遇到了更多解決不了的問(wèn)題或需要外包實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，歡迎隨時(shí)留言哦~咱們下期見(jiàn)！

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