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RNA pull-down實驗注意事項與常見問題由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，普拉特澤生物分子檢測平臺為廣大科研人員提供RNA pull-down實驗外包服務(wù)與技術(shù)咨詢服務(wù)，在大量的實操與技術(shù)咨詢中，我們總結(jié)了很多注意事項，也遇到、聽到了很多實驗問題，見天=我們就把實驗過程中的各種注意事項與常見問題分享給大家，希望能給大家?guī)椭?/span>~

一、RNA pull-down實驗注意事項

1、實驗前期準備

（1）首先是樣本的收集和處理，如果樣本是細胞，要考慮細胞中該RNA的表達量，如果RNA含量較低，那提取出來的RBP可想而知會非常少，建議大家提前準備較多的細胞。（本人的試劑盒要求的量是107個細胞，實驗操作時使用了8個10 cm大皿。）也看到很多小伙伴說可以先進行過表達該RNA后再進行pull-down實驗，大家可以嘗試。

（2）由于該實驗我們提取的目的蛋白和細胞中的RNA含量都較低，因此更需要注意的是：實驗操作過程預防RNA和蛋白的降解！進行實驗的前兩天，一定要準備好實驗需要的槍頭，EP管等。均需無酶無菌！提前高壓，做好準備，實驗進行時，戴好手套和口罩！實驗操作臺提前使用DEPC水擦拭！剩余耗材準備：磁力架，碎冰，低溫高速離心機，冰盒，漩渦振蕩器。

2、實驗操作重點

實驗的操作，一般要注意以下幾個關(guān)鍵步驟。

（1）探針的制備：這步強烈建議大家交給靠譜的公司進行構(gòu)建，便宜好用易上手！

（2）探針-磁珠制備：按照說明書進行操作，沒有任何問題。

（3）蛋白樣本的提取，除核酸：即制備蛋白樣本。如果設(shè)計的組較多，可以選擇分別提取，每次提取的蛋白樣本可短時間內(nèi)，凍存于-80度冰箱低溫保存。

（4）RNA pull-down：同樣是按照說明書進行。重點：到最后一步孵育洗脫后收集上清（即最終樣本），大家可以根據(jù)自己的情況，加適當量buffer（減少量）！例如本人試劑盒上寫60μL，但加上60μL后，蛋白濃度太低，以至于后續(xù)實驗進行有些困難。

二、RNA pull-down實驗常見問題與處理方法

問題1：RNA 降解

可能原因：

1）無核酸酶的環(huán)境被破壞

2）體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針降解

解決方法：

1）清洗和使用新開的離心管和試劑等

2）RNA探針合成后，電泳檢測其長度和濃度

問題2：RNA結(jié)合蛋白的親和力不夠：

可能原因：

1）結(jié)合緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化

2）裂解不完全

3）磁珠用量不足

4）RNA探針用量不足

解決方法：

1）優(yōu)化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件

2）增加裂解液和蛋白上樣量的比例

3）增加裂解液

4）增加磁珠用量

5）增加探針用量

6）確定生物素和鏈霉親和素效率

問題3：RNA結(jié)合蛋白沒有結(jié)合

可能原因：

1）靶蛋白量不足

2）緩沖體系不對

3）RNA探針和蛋白的親和力本來就低

解決方法：

1）增加上樣蛋白量

2）應(yīng)用低鹽體系

3）加入交聯(lián)試劑

問題4：結(jié)合的非特異性高

可能原因：

1）緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化

2）緩沖環(huán)境嚴謹性低

3）樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優(yōu)化

解決方法：

1）優(yōu)化孵育時間溫度鹽濃度等條件

2）使用嚴謹性高的緩沖體系

3）調(diào)低RNA探針和樣品的比例

4）提高裂解液的量

好啦，RNA pull-down實驗注意事項與常見問題咱們就講完啦，如果沒有您遇到的問題的話可以留言給客服，技術(shù)會第一時間給到您回復的，有需要RNA pulldown實驗外包的需求的話歡迎選擇普拉特澤生物！

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