RNA干擾技術
2024-11-12 11:47:38
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
在基因功能研究過程中，我們常常會用到基因干擾技術。盡管大部分人可能聽說過RNA干擾技術，但是對它的了解可能還停留在找生物公司合成序列進行實驗（交給生物公司一段序列，然后生物公司合成，寄回合成的干擾RNA，再按照師兄師姐祖?zhèn)飨聛淼膶嶒灢僮鞑襟E像個無情的機器人一樣一步步操作，然后就會發(fā)現：怎么這個東西對我的基因毫無干擾效果啊，然后開始去找生物公司麻煩，要求退款），對這項技術背后的奧秘卻往往一知半解，更有甚者一無所知。但其實這項技術不僅揭示了生命體內基因表達調控的復雜性，更為疾病治療、基因編輯等領域帶來了革命性的突破，絕對不僅僅是咱們下個單合成后按照步驟操作那么簡單。那本期文章將帶大家深入了解RNA干擾技術的起源、發(fā)展歷程、作用機制以及廣泛的應用領域，希望能給剛接觸RNA干擾技術的小伙伴們提供一些，除蒙著頭做實驗外的一些答疑解惑，同時，也為科研工作者提供一些有價值的參考與啟示
在之前學習中，我們學習了基因表達，如果我們將基因表達比喻為河流中的水流，而基因干擾技術則如同河流中的調控閘門。在正常情況下，基因按照其內在的邏輯和節(jié)奏進行表達，猶如河流中的水流按照地勢和氣候的自然規(guī)律流淌。然而，當我們需要在某些特定情境下調節(jié)或阻斷某些基因的表達時，基因干擾技術便如同調控閘門一樣發(fā)揮作用。這個調控閘門通過接收特定的指令（如RNA干擾技術中的小分子RNA，如siRNA、shRNA或者miRNA），能夠精確地識別并鎖定特定的mRNA分子。一旦這些mRNA分子被鎖定，它們就會被引導至降解途徑，相當于水流被閘門截斷。這樣一來，特定的基因表達就被“閘門”阻擋，實現了對該基因活動的抑制或完全阻斷，從而達到我們期望的調控效果。
了解完之后相信大家對于RNA干擾的機制還處于一知半解的狀態(tài)，別著急，接下來我們帶大家一起來學習并參透其中的奧秘。
RNA干擾現象是一種古老而普遍的生命現象。早在1988年代初，科學家們就開始注意到：雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現象，而后在植物和真菌中相繼發(fā)現雙鏈RNA抑制基因表達的現象，科學家們將其命名為RNA干擾。（。之后他們發(fā)現從單細胞生物到復雜的動植物（如秀麗新小桿線蟲、真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚以及人類等真核生物），無一不存在RNA干擾的現象，通過這些結果，科學家們已經認識到，這絕不是小部分的偶然事件，而是生命體中的，一種普遍存在的基因表達調控機制。因此科學家們開始思考，為什么生物體會進化出RNA干擾這樣的機制呢？這背后究竟隱藏著怎樣的生命奧秘呢？
首先，我們需要從細胞的生活環(huán)境說起。細胞作為生命的基本單位，在漫長的進化歷程中面臨著來自病毒、細菌等外來病原體的不斷侵擾。當第一個被病毒RNA侵擾的細胞出現時，這個幸運的細胞可能恰好擁有一條與病毒RNA互補配對的序列，這條序列就像一把精準的鑰匙，能夠識別并結合病毒RNA，啟動降解過程，將其轉化為無害的碎片。這種偶然但關鍵的互補配對，為細胞提供了一種自我保護機制，即RNA干擾。而有些倒霉蛋細胞，它們沒有這條“幸運”序列，因此無法有效抵御病毒的入侵，從而更容易被病毒消滅，這也是達爾文自然選擇、適者生存法則在微觀世界的體現。隨著時間的推移，越來越多的細胞發(fā)覺要想不做倒霉蛋，不被病毒RNA消滅，就必須要進化出這種RNA干擾機制。它們不僅能夠識別并降解病毒RNA，還能夠調節(jié)自身基因的表達，從而適應不同的環(huán)境變化。
在siRNA和shRNA還未發(fā)現之前，RNA干擾的主角是天然存在于生物體內的miRNA。前體miRNA經過一系列的加工過程最后得到了成熟的miRNA，隨后成熟的miRNA再和特定的蛋白質（RISL蛋白）形成了一個RNA誘導的沉默復合體RISC。RISC在細胞質中巡邏，尋找著與其攜帶的miRNA互補的mRNA。一旦一個靶mRNA與miRNA形成堿基配對，該mRNA就會瞬間被存在于RISC中的核酸酶降解掉，一旦RISC解決好了一個mRNA分子后，RISC便得到了解放，就可以著手于再去尋找新的mRNA分子，由此高效的阻斷mRNA編碼的蛋白質的產量，根據配對程度的不同，靶mRNA要么在RISC中被核酸酶降解，要么就被轉移到細胞質中被其他的細胞核酸酶所摧毀。
如何來理解這個過程呢？我們可以把RISC復合體看做城市里的特工隊：RISC特工隊在細胞質這個繁忙的城市中巡邏，他們的任務是搜尋那些與miRNA“密碼”相匹配的mRNA“嫌疑犯”。每當RISC發(fā)現一個可以與miRNA配對的mRNA目標時，隊伍中的“核酸酶特工”會立即采取行動。根據“嫌疑犯”的“罪行”輕重（即配對程度的不同），RISC有兩種處理方式：一種是直接在現場（RISC內部）用核酸酶將其“逮捕并銷毀”；另一種則是將其“移送”到細胞質的其他區(qū)域，由其他“細胞核酸酶警察”進行進一步的處理和摧毀。一旦RISC成功處理完一個mRNA分子，他們就如同完成了一次任務，重新整裝待發(fā)，繼續(xù)在城市中巡邏，尋找下一個目標。這樣的工作方式讓RISC能夠高效地阻止mRNA所編碼的蛋白質“罪犯”的產生，從而維護細胞內的基因秩序和安全。
在RNA干擾包括許多的小分子RNA如miRNA、siRNA和shRNA，其中miRNA（微小RNA）無疑是最耀眼引人注目的一類。在今年的10月7日，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎頒發(fā)給了美國的兩位科學家（Victor Ambros和Gary Ruvkun），他們因發(fā)現microRNA及其在轉錄后基因調控中的作用而共同獲得這一獎項，這一事件更是將miRNA的研究推向了新的熱潮。那么，miRNA究竟是什么呢？
miRNA是一類長度約為20-25個核苷酸的非編碼內源性RNA分子。它們廣泛存在于生物體內，通過調節(jié)基因的表達來參與多種生物過程。盡管大家可能只知道miRNA能夠與靶基因的3’UTR區(qū)配對并降解mRNA，但miRNA的功能遠不止于此。事實上，miRNA具有多種功能，包括阻止翻譯過程、降低RNA的穩(wěn)定性以及在某些情況下激活翻譯等。
阻止翻譯過程：當miRNA與靶mRNA的3’UTR部分互補配對時，它們會形成一個雙鏈結構。這個結構會阻止核糖體與mRNA的結合，從而抑制翻譯過程的起始。即使核糖體已經與mRNA結合，miRNA也可以干擾tRNA對密碼子的識別，導致翻譯過程的提前終止。
降低RNA的穩(wěn)定性：除了抑制翻譯，miRNA還可以通過誘導靶mRNA的降解來降低其穩(wěn)定性。這通常發(fā)生在miRNA與靶mRNA的序列部分互補但并非完全互補的情況下。通過結合特定的酶（如Dicer酶和RISC復合體），miRNA可以引導這些酶對靶mRNA進行切割，從而使其降解。
在某些情況下激活翻譯：近期的研究發(fā)現，miRNA并非總是抑制翻譯。在某些情況下，它們也可以激活翻譯。這通常發(fā)生在細胞核內，通過結合增強子來激活基因表達，這種miRNA被稱為NamiRNA（nuclear activating miRNA）。然而，這種激活作用的具體機制尚不完全清楚，需要進一步的研究來揭示。
一般來說，這些不同功能的實現，取決于miRNA與靶基因之間的，互補配對的堿基數目的多少即配對的程度。當miRNA與靶mRNA的3’UTR區(qū)部分互補時，它們就會形成雙鏈結構并抑制翻譯過程；而當miRNA與靶mRNA的序列完全互補時，它們就會直接降解靶mRNA。也就是說互補配對的堿基越多，基因干擾的效果就越好。
然而，我們在實驗過程中會發(fā)現一個有趣的現象是：當我們在細胞中過表達miRNA后，其QCR（定量反轉錄PCR）結果不顯著，但是蛋白水平卻顯著下降呢？這主要是因為miRNA的作用機制是在轉錄后水平上進行調節(jié)的。即使mRNA的轉錄水平沒有顯著變化，miRNA仍然可以通過抑制翻譯過程或降解mRNA來降低蛋白的表達水平。
由于miRNA與靶mRNA之間的堿基配對不需要完全互補，因此它們可以識別并調節(jié)多個靶基因的表達，也就是說一個miRNA可以對應多個mRNA序列進行干擾和調節(jié)。同時，miRNA作為內源性RNA分子，在細胞內的存在和作用更加復雜且微妙，它們可以通過與靶mRNA的結合來影響其穩(wěn)定性、翻譯效率以及與其他分子的相互作用等。
科學家在解析了miRNA的作用機制后開始意識到，由于靶點眾多，miRNA的靶向性相對而言可能不夠精確，有時難以準確而有效地阻斷特定基因的表達。這種靶向性的不足，在一定程度上限制了miRNA在基因調控領域的應用范圍和效率。
因此科學家們發(fā)明了siRNA（小干擾RNA）這一人造的RNA干擾工具。siRNA是一種長度為21-23個核苷酸的雙鏈RNA分子。它們通常通過化學合成或體外轉錄等方法獲得，并可以與特定的靶mRNA序列完全互補配對。其作用機制與miRNA相似：當雙鏈siRNA進入細胞后，它們會被RISC復合體識別并切割成單鏈形式。然后，單鏈siRNA會與靶mRNA結合并引導RISC復合體對其進行切割或降解。與miRNA不同的是，siRNA是非內源性的RNA分子而是人為設計合成的，我們可以對其序列、結構和活性可以進行精確的控制和調整，因此siRNA通常比miRNA具有更強的精準性和靶向性。
siRNA一般有兩種靶向序列：一種是CDS序列（編碼序列），另一種是調控區(qū)（即非編碼區(qū)，如啟動子、增強子和轉錄因子等所在的區(qū)域）。由于CDS序列與蛋白質的氨基酸序列直接相關，因此針對CDS設計的siRNA能夠高度特異性地識別并降解目標mRNA，從而顯著抑制靶基因的表達。而靶向調控區(qū)的siRNA設計的基因干擾過程通常涉及DNA的甲基化，因此會導致基因沉默而非降解mRNA。同時由于調控區(qū)的序列復雜性較高，且不同基因之間的調控機制存在差異，靶向調控區(qū)的siRNA可能通過影響基因表達的調控過程來間接調節(jié)基因表達水平，但其作用機制和效果可能相對復雜和難以預測。因此在我們設計siRNA時可盡量選擇CDS區(qū)來進行設計以提高其干擾效果。
然而，siRNA的發(fā)展也面臨著一些挑戰(zhàn)。由于siRNA是非內源性的RNA分子，它們在細胞內的穩(wěn)定性和持久性相對較差。同時，siRNA的轉染效率和靶向性也受到多種因素的影響，如細胞類型、轉染方法、siRNA序列設計等。這些因素限制了siRNA在基因治療等領域的應用。
為了克服這些挑戰(zhàn)，科學家們在siRNA的基礎上發(fā)明了shRNA。shRNA是一種具有特殊結構的RNA分子，它們可以形成一個短發(fā)夾結構并包含兩個互補的序列，且通過載體病毒等介質進入細胞。當shRNA進入細胞后，它們會被細胞內的酶識別并切割成兩個單鏈形式的siRNA分子。然后，這兩個siRNA分子會分別靶向并降解不同的靶mRNA序列。
shRNA的出現解決了siRNA瞬時效應的問題。由于shRNA可以在細胞內持續(xù)產生siRNA分子，因此它們可以實現持續(xù)穩(wěn)定的基因干擾效果。這種特性使得shRNA在基因治療、疾病模型構建等領域具有更廣泛的應用前景。
此外，還有一個有趣的問題值得探討：能否用RNA干擾技術干擾掉RNA干擾現象呢？這個問題看起來似乎有些抽象和自相矛盾，但其實目前市面上售賣的許多miRNA的抑制劑可以不就可以完美解決這個問題嗎？這些抑制劑通過與miRNA結合來阻止其與靶mRNA的配對和切割過程，從而抑制RNA干擾現象。同樣地，我們也可以設計針對siRNA或shRNA的抑制劑來干擾它們的作用效果。這種策略為RNA干擾技術的調控和應用提供了新的思路和方法。
在了解了RNA干擾技術的起源、發(fā)展歷程以及miRNA、siRNA和shRNA的具體作用機制后，接下來我們對這三類小分子RNA進行一個總結，分析下他們的異同。
1. 差異：
① 來源與性質：miRNA是內源性的RNA分子，而siRNA和shRNA則是人造的非內源性RNA分子。
② 持久性與穩(wěn)定性：由于miRNA是內源性的，它們在細胞內的存在和作用更加穩(wěn)定且持久；而siRNA則存在瞬時效應的問題，需要頻繁轉染才能維持干擾效果（這也是為什么通常我們會發(fā)現siRNA在轉染后72-96h干擾效果非常不好的原因）；shRNA則通過持續(xù)產生siRNA分子來解決這一問題。
③ 靶向性：siRNA和shRNA具有更強的精準性和靶向性，可以針對特定的靶mRNA序列進行干擾，一對一；而miRNA的靶點通常非常多，一個miRNA可以對應多個mRNA序列進行干擾和調節(jié)，一對多。
2. 相似之處：
① 作用效果：無論是miRNA、siRNA還是shRNA，它們都屬于基因沉默的范疇。它們都是通過特定的RNA分子與靶mRNA序列進行配對和切割來實現基因表達的抑制或調節(jié)。
② 原理與結構：這三類RNA都遵循著相似的原理和結構特點。它們都通過堿基配對來識別并切割靶RNA分子；同時，它們都具有特定的序列和結構特征來確保其功能的實現。
總的來說，RNA干擾技術作為技能功能研究領域的一項革命性突破，為我們提供了強大的工具和方法來研究和調控基因表達。通過深入了解miRNA、siRNA和shRNA等RNA分子的作用機制和特點，我們可以更好地利用這些工具來探索生命的奧秘并為疾病治療、基因編輯等領域帶來新的希望和突破。本期內容就講到這里，想看視頻版本的可以直接點擊【RNA干擾：你真的了解它的奧妙嗎？】
希望能對大家有所啟示！謝謝大家。
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