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一、彗星實驗的背景與原理

在了解彗星電泳之前，先了解一下DNA損傷的類型，比如單堿基的突變、單堿基的缺失、多堿基的突變、多堿基的缺失以及雙鏈的斷裂、堿基的插入、編輯等。

而造成DNA損傷的因素主要有以下幾點：ROS活性氧、紫外線、抗腫瘤藥物。

分子水平檢測DNA損傷的方法有以下幾個：

WB：檢測γH2AX

qPCR：檢測DNA損傷表達

彗星電泳：單細胞凝膠電泳

1984年，Ostling和Johanson第一次用中性彗星電泳定量細胞中的DNA損傷；而中性彗星電泳只能檢測雙鏈的DNA損傷；后來Singh發(fā)展出堿性彗星電泳，它是一種更靈敏的方法，可檢測單鏈、雙鏈的DNA損傷和堿不穩(wěn)定性位點DNA交聯(lián)及不完全切除修復(fù)位點等多種DNA損傷，適用于檢測各種物質(zhì)的基因毒性。

彗星電泳的實驗原理：

電泳過程中，帶負電荷的DNA會向正極移動，DNA損傷會產(chǎn)生小的DNA碎片，這些碎片會在瓊脂糖凝膠中移動，形成彗星狀拖尾，而完整的DNA是因其分子量比較大，無法從細胞核遷移出來。

二、彗星電泳實驗步驟和結(jié)果分析

實驗步驟

實驗步驟有兩個關(guān)鍵需要注意一下：

1、實驗過程避光；

2、裂解液pH調(diào)至10；

實驗結(jié)果與分析

陰性對照沒有拖尾的形狀

而陽性對照組有很明顯的拖尾形狀

對于拖尾率的計算有專門的計算公式，首先要統(tǒng)計到尾部DNA的含量，即尾部DNA的光強度比上整個細胞的光強度，計算公式詳見下圖：

三、彗星電泳實驗的適用范圍

主要用于檢測基因毒性，例如，檢測藥物的基因毒性。

優(yōu)點：靈敏、直觀、低成本，需要的細胞數(shù)量少，實驗周期相對短，可以廣泛應(yīng)用于各種細胞；

缺點：1、易受環(huán)境影響，例如紫外、氧化壓力；

    2、該實驗的通量受限于玻片；

    3、只能簡單的反映細胞內(nèi)碎片化DNA的比例，要全面分析DNA損傷還需要其他實驗的佐證。

四、彗星電泳經(jīng)典案例一覽

五、彗星實驗常見問題及分析

問題1：對照組出現(xiàn)拖尾

原因：樣品消化過度或者樣品反復(fù)凍融

問題2：沒有拖尾

原因：細胞裂解不充分

問題3：鋪的膠易脫落

原因：膠凝固時間不夠

問題4：背景太臟

原因：瓊脂糖凝膠，裂解緩沖液和解旋緩沖液都要現(xiàn)配現(xiàn)用。

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