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Question：很多人WB結(jié)果不好，卻沒懷疑過自己的膠選錯了（普拉特澤生物提供長期穩(wěn)定的wb實驗外包服務(wù)）

一、凝膠濃度對蛋白有哪些影響呢?

把聚丙烯酰胺凝膠想象成一個分子篩網(wǎng)：

1）高濃度膠（如15%）：網(wǎng)眼小，小蛋白能靈活穿梭，大蛋白則寸步難行

2）低濃度膠（如8%）：網(wǎng)眼大，大蛋白可以自由奔馳，小蛋白卻可能“剎不住車”

選錯濃度會怎樣？

1）膠太濃：大蛋白分離不開，擠成一團(tuán)

2）膠太?。盒〉鞍着艿锰欤苯印芭軄G”

二、到底應(yīng)該怎么選擇濃度膠呢?

濃度膠選擇技巧：

1）不確定時選10%：適合大多數(shù)常見蛋白（這也是我們常用的濃度膠）

2）大蛋白用低濃度：更容易分離且轉(zhuǎn)膜更充分

3）梯度膠是神器：從上到下濃度遞增，一塊膠搞定不同大小蛋白

特殊分離膠濃度需要考量：

1）應(yīng)對超大或超小分子量蛋白

對于大于200 kDa的蛋白，比如200 kDa或280 kDa的蛋白，推薦使用6%或7% 的分離膠，并適當(dāng)延長電泳時間。

對于小于20 kDa的小分子蛋白或多肽，常規(guī)的Tris-甘氨酸系統(tǒng)分離效果可能不佳。這時，Tris-Tricine緩沖系統(tǒng)的預(yù)制膠（例如16.5% 的濃度）是更好的選擇，它能更有效地分離2-40 kDa的小分子量蛋白。

2）使用梯度膠應(yīng)對寬范圍或不同大小的蛋白
如果需要分離的蛋白分子量分布很廣，或者想在同一塊膠上同時分析多個不同大小的蛋白，梯度膠（例如4-12% , 4-20% ）會非常方便。它從膠頂?shù)侥z底的濃度是連續(xù)變化的，因此可以在同一塊膠上清晰地分離出分子量差異很大的蛋白。

三、經(jīng)驗

由于我的研究課題涉及到的蛋白分子量在15-150kd范圍內(nèi)，所以我常用的就是雅酶10%的一步法預(yù)混膠，下面給大家看看電泳的效果吧

??這是剛開始跑的時候

?? 這是快要結(jié)束的時候

、

四、我們WB時需要關(guān)注濃度膠的那些情況呢？

1.根據(jù)自己的目標(biāo)分子選擇對應(yīng)的濃度膠，保證蛋白電泳過程中順利下沉及分開，不懂時可以咨詢一下師兄師姐，特別是與他人蛋白kd數(shù)差距甚遠(yuǎn)時。

2.配膠時一定要注意添加手法，學(xué)姐一直推薦左右滑動著加上下層膠，因為在玻璃板的一角加入，容易導(dǎo)致配膠濃度不均，即使添加前已吹打混勻，添加完畢+插完梳子以后，將制膠架于實驗桌上輕磕一下，保證分界線平齊。

3.配膠后凝固時間適當(dāng)，學(xué)姐真的不建議提前配膠，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，學(xué)姐之前在北方，夏天冬天溫差不是特別大（因為北方有暖氣），所以我夏天和冬天的凝膠時間都是固定的。但是學(xué)姐現(xiàn)在到南方了，冬天的時候氣溫低，凝膠時間就需要延長20-30min，或者多添加一些促凝劑，以便縮短凝膠時間。

判斷濃度膠凝固知識點：插梳子以后，玻璃板會多出一部分上層膠流在制膠架上，我們可以等待20-30min以后，將玻璃板拆卸下來，看看多余的膠是否凝好，若是呈膠條狀，則代表膠已凝好，可以電泳。

4.注意緩沖液系統(tǒng),分離小分子量蛋白（<20 kDa）時，記得Tris-Tricine系統(tǒng)比常規(guī)的Tris-甘氨酸系統(tǒng)效果更好。

5.預(yù)制膠是很多同學(xué)的優(yōu)先選擇，因為可以節(jié)省配膠時間，但是一定要注意預(yù)制膠的保存以及使用方法，否則可能會讓你浪費更多的時間去試錯。對于大分子量蛋白，有建議使用6%的分離膠，而小分子量蛋白則可選用16.5%的Tricine預(yù)制膠，常規(guī)分子量推薦10%的預(yù)制膠。

文源【醫(yī)學(xué)盛夏學(xué)姐】

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