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蛋白原核表達(dá)-從原理到實(shí)操超詳細(xì)教程【蛋白表達(dá)】

寶子們，做生物實(shí)驗(yàn)的一定對(duì)蛋白原核表達(dá)不陌生！今天噗啦噗啦實(shí)驗(yàn)室就來(lái)給大家奉上一份超全攻略，從核心原理到操作步驟，手把手帶你玩轉(zhuǎn)蛋白原核表達(dá)

一、原核表達(dá)核心原理

1.技術(shù)本質(zhì)

通過(guò)基因工程手段，將目標(biāo)基因插入表達(dá)載體后導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)，利用細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，實(shí)現(xiàn)外源蛋白質(zhì)的高效合成。這一技術(shù)通過(guò)重組表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)解析和功能研究提供了關(guān)鍵工具。

2.應(yīng)用場(chǎng)景

①蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛:

②純化制備:獲取高純度蛋白質(zhì)，用于生物化學(xué)分析或結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究;

③亞細(xì)胞定位:揭示蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布規(guī)律，解析其功能機(jī)制;

④結(jié)構(gòu)域分析:通過(guò)分段表達(dá)不同蛋白片段，研究結(jié)構(gòu)與功能的對(duì)應(yīng)關(guān)系;

⑤功能驗(yàn)證:為體外模擬蛋白質(zhì)在生理或病理過(guò)程中的作用提供實(shí)驗(yàn)材料，助力疾病診療研究。

3.系統(tǒng)分類

→蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)主要分為原核與真核兩大類，其中原核系統(tǒng)包括:

→大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng):最常用的原核平臺(tái)，具有遺傳背景清晰、表達(dá)效率高、培養(yǎng)周期短(僅需幾小時(shí))、抗污染能力強(qiáng)、技術(shù)成熟且成本低廉等優(yōu)勢(shì)，適用于大多數(shù)重組蛋白的表達(dá);

→芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng):分泌能力強(qiáng)，產(chǎn)物易于純化，適合需要分泌表達(dá)的蛋白質(zhì);

→鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng):常用于抗生素相關(guān)酶的生產(chǎn)，利用其天然代謝特性合成特定功能蛋

4.大腸桿菌系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)

大腸桿菌作為原核表達(dá)的首選宿主，具備以下核心優(yōu)勢(shì):

基因組信息研究透徹，便于基因工程操作;

短時(shí)間內(nèi)可大量合成目標(biāo)蛋白，滿足實(shí)驗(yàn)與生產(chǎn)需求;

培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單(如 LB 培養(yǎng)基)，適合大規(guī)模放大培養(yǎng);

實(shí)驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化程度高，操作流程成熟易掌握;

菌株和質(zhì)粒資源豐富，可根據(jù)蛋白特性靈活選擇表達(dá)載體。

二、原核表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

1.轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài) BL21/DE3菌株，常用熱激法(42°C短暫處理)或電轉(zhuǎn)化法，優(yōu)化操作以確保高效轉(zhuǎn)化，篩選出含有目標(biāo)基因的陽(yáng)性克隆。

2.擴(kuò)大培養(yǎng)

在 500ml 滅菌 LB 培養(yǎng)基中加入對(duì)應(yīng)抗性抗生素(終濃度 50-100ug/ml)，挑取單菌落接種后于 37°C搖床培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)(通

常 OD<sub>600</sub>為 0.6-0.8)

3.誘導(dǎo)過(guò)夜

取 100m 誘導(dǎo)前菌液(標(biāo)記為 Pre-l)保存作為表達(dá)基線對(duì)照

剩余菌液中加入IPTG(終濃度 0.1-0.5mM)，18°C過(guò)夜誘導(dǎo)，促使目標(biāo)基因表達(dá)。

4.菌體收集

誘導(dǎo)后的菌液經(jīng) 4000rpm 離心 25 分鐘，棄上清后，用 30-35mI Ni-A 緩沖液(適用于 His 標(biāo)簽蛋白)重懸菌體，轉(zhuǎn)移至離心管備用。

5.超聲裂解

冰浴條件下，用超聲波破碎儀裂解菌體(功率200W，工作周期3秒開(kāi)/3秒停，總時(shí)長(zhǎng)9分鐘，分3次操作)，隨后通過(guò) Bradford 法檢測(cè)裂解液中的總蛋白濃度，驗(yàn)證裂解效果

6.離心分層

裂解液于 4°℃、4000rpm 離心 25 分鐘，分離出上清液(SUP，含可溶性蛋白)和沉淀(PPT含包涵體或細(xì)胞碎片)，分別保留用于后續(xù)分析。

7.鎳柱純化

▲平衡:先用高濃度咪唑的 Ni-B 緩沖液(如400mM)沖洗鎳柱去除雜質(zhì)，再用低濃度咪唑的 Ni-A 緩沖液(如 20mM)平衡柱子;結(jié)合:將上清液與鎳柱填料混合，4°C孵育1-1.5 小時(shí)，使 His 標(biāo)簽蛋白與鎳離子充分結(jié)合;

▲洗雜與洗脫

過(guò)柱后收集穿流液(UB)，檢測(cè)未結(jié)合的雜蛋白，評(píng)估結(jié)合效率;

用 Ni-A 緩沖液洗去雜蛋白(收集 WS樣本)，再用 Ni-B緩沖液洗脫目的蛋白(收集E樣本)，通過(guò) Bradford 試劑監(jiān)測(cè)至無(wú)雜蛋白釋放。

8.變性與電泳將目的蛋白樣本(E)、Pre-1、SUP、PPT.UB、WS 等分別加入 Loading Buffer，95°C變性 10 分鐘，使蛋白完全解鏈，隨后進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳(200V，40分鐘)，分離不同分子量的蛋白條帶

9.染色分析

電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠染色通過(guò)微波爐輔助脫色(加熱后搖床洗脫)，直至清晰顯示蛋白條帶，對(duì)比 Marker 判斷目標(biāo)蛋白的分子量和表達(dá)量。

三、關(guān)鍵樣本類型與作用

在原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，需收集多種樣本以評(píng)估各環(huán)節(jié)效果:

Pre-l(誘導(dǎo)前菌液):誘導(dǎo)劑加入前的菌體樣本，用于對(duì)比誘導(dǎo)前后的蛋白表達(dá)基線判斷誘導(dǎo)是否有效;

Induced(誘導(dǎo)后菌液):加入IPTG后的菌體樣本，驗(yàn)證外源蛋白是否成功表達(dá)及表達(dá)水平;

SUP(上清液):離心后的可溶性蛋白樣本，反映目標(biāo)蛋白是否以可溶形式存在于細(xì)胞中;

PPT(沉淀):離心后的包涵體或細(xì)胞碎片樣本，提示目標(biāo)蛋白是否形成不可溶的包涵體，需進(jìn)一步復(fù)性處理;

UB(穿流液):鎳柱純化中未結(jié)合的液體，用于檢測(cè)目標(biāo)蛋白與鎳柱的結(jié)合效率及雜蛋白殘留量;

WS(洗雜液):洗去雜蛋白的流出液，監(jiān)測(cè)純化柱是否干凈，雜蛋白去除是否徹底

E(洗脫液):最終收集的目的蛋白樣本，用于驗(yàn)證純化后的蛋白純度和得率。

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