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CCK8，全稱為Cell Counting Kit-8，是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。普拉特澤生物承接CCK8等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)服務(wù)上萬例，積累了操作大量經(jīng)驗(yàn)，為大家詳細(xì)分享cck8檢測實(shí)驗(yàn)報(bào)告，同時(shí)為廣大科研工作者開展線上的理論培訓(xùn)與線下實(shí)操，可承接細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

檢測THP-1-oe-NC、THP-1-oe-SLC25A37細(xì)胞增殖能力的變化。

二、實(shí)驗(yàn)樣品

1.實(shí)驗(yàn)樣本

備注：包括干預(yù)細(xì)胞用的相關(guān)試劑均按實(shí)驗(yàn)樣品登記，每行登記一個(gè)或一組獨(dú)立樣品。
2. 實(shí)驗(yàn)參數(shù)

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1：CCK8法檢測細(xì)胞OD值

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

如圖所示，與oe-NC組相比，感染oe-SLC25A37病毒組細(xì)胞增殖能力上調(diào)。

五、實(shí)驗(yàn)原理

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

六、實(shí)驗(yàn)通用儀器及試劑

1.主要儀器

2.主要試劑

七、實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 細(xì)胞復(fù)蘇

(1) 將ddH₂O預(yù)溫至37℃。

(2) 戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管（內(nèi)有1 mL細(xì)胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內(nèi)快速溶解。

(3) 完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進(jìn)超凈臺。

(4) 在超凈臺中，在15 mL滅菌離心管中預(yù)先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細(xì)胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。

(5) 1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(6) 48小時(shí)后換液，細(xì)胞融合接近80%時(shí)即可傳代。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1-oe-NC、THP-1-oe-SLC25A37細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的1640培養(yǎng)基，在37℃飽和濕度、含5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.3 細(xì)胞鋪板

(1) 取對數(shù)生長期THP-1-oe-NC、THP-1-oe-SLC25A37細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(2) 將細(xì)胞種到96孔板中，密度為20000個(gè)細(xì)胞/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。

(3) 待細(xì)胞貼壁后，0、24、48、72h后進(jìn)行cck8檢測。

3.4 CCK8檢測實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 各組細(xì)胞在檢測時(shí)間點(diǎn)時(shí)，每孔加1/10體積 CCK8，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)；

(2) 選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制折線圖。

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