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TUNEL染色實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)操作技巧【詳細(xì)篇】

TUNEL染色是一種常用的細(xì)胞凋亡檢測方法。它基于凋亡過程中DNA雙鏈斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將標(biāo)記的dUTP連接到DNA斷裂處，從而檢測凋亡細(xì)胞。普拉特澤生物承接TUNEL染色等病理染色相關(guān)服務(wù)上萬例，積累了操作大量經(jīng)驗(yàn)，為大家詳細(xì)分享TUNEL染色實(shí)驗(yàn)報(bào)告步驟，同時為廣大科研工作者開展線上的理論培訓(xùn)與線下實(shí)操，可承接染色實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

采用TUNEL染色技術(shù)檢測細(xì)胞樣本中的凋亡水平。

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時抽提DNA進(jìn)行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180~200bp的DNA ladder?；蚪MDNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上生物素標(biāo)記的dUTP，在DAB的存在下，產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），從而可以通過顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的情況

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.主要儀器耗材

2.主要試劑

四、方法步驟

1.固定

(1) 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用生理鹽水浸洗3次；

(2) 用4%的多聚甲醛固定爬片15min，生理鹽水浸洗玻片3次；

2. 通透

1) 蛋白酶K修復(fù)：每個樣本上滴加100 μL蛋白酶K工作液，37℃反應(yīng)30 min；

2) PBS浸洗3次各5 min。

3 .標(biāo)記

1) 每樣滴加50μL的Tunel反應(yīng)混合物，TdT酶：Biotin-dUTP=1：9配制，37℃避光孵育60 min；

2) PBS洗滌1次，滴加反應(yīng)終止液室溫孵育10min；PBS洗滌5min×3次；

3) 每個樣本滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，濕盒中37℃避光反應(yīng)30 min；

4) PBS充分浸洗3次各5 min。

4. 顯色

1) 根據(jù)說明書配制DAB顯色液；

2) 每個樣本滴加50 μL DAB顯色工作液，室溫顯色30s-5min；

3) 蒸餾水稍洗終止顯色。

5. 復(fù)染

1) 蘇木素染色30 s；

2) 流水沖洗2 min。

6.分化返藍(lán)

1) 1%鹽酸酒精分化2 s；

2) 流水沖洗切片5 min。

7.干燥封片

1) 爬片自然干燥；

2) 在載玻片的中央滴加適量中性樹膠，將爬片反扣在樹膠上封固；

2) 在通風(fēng)櫥內(nèi)室溫晾干。

8.鏡檢

顯微鏡下觀察拍照。

希望這篇文章能幫助你更好地理解和分析TUNEL染色實(shí)驗(yàn)報(bào)告步驟。如果你有任何疑問或建議，歡迎在評論區(qū)留言交流。讓我們一起學(xué)習(xí)進(jìn)步吧！