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  普拉特澤生物為廣大生命科學(xué)研究人員提供QPCR檢測實驗，可根據(jù)實方案的要求選擇不同的檢測方法，本文就跟大家一起繼續(xù)闡述QPCR檢測實驗詳細的步驟與報告。
一、實驗?zāi)康?/span>

通過QPCR實驗技術(shù)定量檢測基因表達量。

二、實驗樣品及分組

1. 實驗樣本

備注：包括干預(yù)細胞用的相關(guān)試劑均按實驗樣品登記，每行登記一個或一組獨立樣品。

2 .實驗分組

細胞： SH-SY5Y

分組：

常規(guī)培養(yǎng)條件：完全培養(yǎng)基，95%空氣+5%二氧化碳；

OGD培養(yǎng)條件：無糖Earle液，95%氮氣+5%二氧化碳處理4h，復(fù)氧復(fù)糖24h

指標(biāo)：1、核質(zhì)分離后檢測lncRNA BDNF-AS（NR_002832.2）

2、提取總RNA檢測BDNF（Gene ID: 627）、APP（ Gene ID: 351）、BACE1（ Gene ID: 23621）、BDNF-AS的表達（默認最長的轉(zhuǎn)錄本）

三、實驗結(jié)果

四、實驗材料

1.主要實驗儀器

2.主要實驗試劑及耗材

五、實驗原理

QPCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。根據(jù)熒光信號的變化能夠?qū)崟r檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析就能對起始模板進行定量分析。

六、實驗步驟

1.引物設(shè)計

2.樣品前期處理

向細胞樣本中加入500 μl Trizol。
3. RNA提取

(1)     向加有Trizol的1.5 ml EP管中加入100 μl氯仿，震蕩混勻后，靜置5 min，在12000 rpm，4度離心10 min。

(2)     從離心機中取出1.5 ml EP管，再將上層無色透明的水相層吸入到另一干凈的1.5 mlEP管中。（樣品會分為三層：下層有機相層，中間層和上層的水相層，RNA位于上層水相中。）加入等體積的異丙醇，上下輕輕顛倒混勻之后，靜置10 min，再12000 rpm，4度離心10 min。

(3)     離心之后可在EP管壁或管底看到膠狀沉淀出現(xiàn)，沉淀就是要提取的RNA。小心棄去上清，不要將沉淀倒掉了。

(4)     用1 ml 75℅乙醇對RNA沉淀進行洗滌。然后于4℃ 7000 rpm離心5分鐘，將上清盡量去除干凈。

(5)      室溫靜置干燥，大約干燥5～10分鐘即可。（不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低）。所有EP管中加入25 μl 的DEPC H₂O，用槍頭吹打幾次，使RNA充分溶解，-80℃保存。

(6)     RNA濃度檢測：使用核酸蛋白檢測儀檢測RNA濃度。

4.RNA濃度及純度測定

（見實驗結(jié)果部分）

5.逆轉(zhuǎn)錄PCR

1. 按以下組份分別配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

  2.cDNA立刻進行實驗或者置于4℃保存。

六、實時熒光定量PCR反應(yīng)

1. 反應(yīng)體系的配置

2.反應(yīng)條件設(shè)置：

     擴增程序：

3.熔解程序

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